Газета «Новости медицины и фармации» Гастроэнтерология (294) 2009 (тематический номер)

Воспалительные заболевания кишечника, в частности неспецифический язвенный колит (НЯК), являются серьезной медико-социальной проблемой [1, 6, 10, 11]. Сложность и многогранность патогенеза НЯК, гетерогенность возникающих иммунных и метаболических сдвигов предопределяют необходимость включения в терапевтический комплекс больных НЯК противовоспалительной терапии [4, 5, 13]. Эффективность препаратов, входящих в базисную терапию НЯК, оценивается по уменьшению или устранению развившихся воспалительных, цитокиновых, иммунных и морфологических нарушений [7, 9]. При этом исчезновение этих изменений свидетельствует о ликвидации острого воспаления в кишечнике, индукции ремиссии НЯК. Прогнозирование стабильности ремиссии в большей степени может быть связано с цитопротективными эффектами лекарственных препаратов, нормализацией слизистого барьера толстой кишки. Состояние слизистого барьера толстого кишечника определяется функциональными изменениями слизистой оболочки толстой кишки, свойствами толстокишечной слизи, количественным и качественным составом кишечной микрофлоры [2, 3, 12]. Цитопротективное воздействие базисной терапии НЯК, влияния на слизистый толстокишечный барьер позволят не только оценить эффективность ликвидации обострения, но и прогнозировать дальнейшее течение заболевания.

Одним из основных препаратов базисной терапии НЯК в настоящее время является месалазин, который блокирует липооксигеназный путь метаболизма арахидоновой кислоты и за счет этого обладает выраженной противовоспалительной активностью. Цитопротективное действие месалазина, его влияние на состояние слизистого барьера толстой кишки у больных НЯК изучено недостаточно.

Целью данной работы была оценка цитопротективного влияния месалазина на слизистый барьер толстого кишечника у больных НЯК.

Было обследовано 60 пациентов с левосторонним НЯК в стадии обострения, среди которых было 32 мужчины и 28 женщин. Средний возраст составлял 36,2 ± 4,2 года. Помимо общеклинических методов обследования всем больным НЯК было проведено повторное эндоскопическое исследование с биопсией слизистой оболочки толстой кишки и морфологическим исследованием биоптата. Фиксация биоптата слизистой толстой кишки проводилась в 4% растворе нейтрального формалина на одни сутки с последующей заливкой в парафин. Гистологические срезы толщиной 4–5 микрон производили на микротоме для парафиновых срезов. Срезы окрашивали гематоксилин-эозином, что позволило получить общие представления и оценить состояние исследуемой ткани. По этому препарату оценивали выраженность воспаления в слизистой оболочке толстой кишки, интенсивность и клеточный состав инфильтрата, количество и зрелость бокаловидных клеток [8]. Для характеристики слизеобразования проводилась PAS-реакция, с помощью которой выявляли гликопротеиды, гликолипиды и гликоген. При исследовании этих препаратов определяли количество PAS-положительных веществ в слизи и число активных лейкоцитов, содержащих гликоген в клеточном инфильтрате. Другие срезы окрашивали альциановым синим при значениях рН 1,0 и 2,5. При рН 1,0 сульфатные группы углеводов приобретают достаточный заряд для связывания положительно заряженных молекул красителя. При рН 2,5 окрашивали как сульфатные, так и карбоксильные группы углеводов, которые входят в состав сиаловых, глюкуроновой и индуроновой кислот. С помощью этой методики определяли сульфатированные и несульфатированные гликозаминогликаны, протеогликаны, гликопротеины и гликоген [3, 8]. Проводилась также лектинная гистохимия с использованием меченых пероксидазой лектинов. Применялись следующие лектины: завязей пшеницы WGA-тропного к N-ацетилглюкозамину, N-ацетилнейраминовой кислоте (сиаловой кислоте) (NANA), арахиса PNA-тропного к β-D-галактозе (β-DGal), бобовника анагиралистного LAL-тропного к α-L-фукозе (α–LFuc), омелы белой ML-1-тропного к α-L-галактозе (α-DGal), сои SBA-тропного к α-N-ацетилгалактозамину (α-DGalNAc), D-галактозе, семян чечевицы LCA-тропного к α-D-маннозе (α-DMan), D-глю-

козе, N-ацетилглюкозамину, виноград-ной улитки HPA-тропного к α-N-ацетил-глюкозамину (α-GlcNAc), бузины чер-ной SNA-тропного к D-галактозамину (α-GalNAc). Лектинная гистохимия по чувствительности и селективности в выявлении определенных молекулярных структур значительно превосходит традиционные методы гистохимии углеводов, что позволяет использовать этот метод в определении отдельных олиго- и дисахаридов при расшифровке состава муцинов. Кроме того, по ней можно оценивать количество специфических рецепторов не только в эпителиальных клетках, но и в строме. Состояние рецепторного аппарата колоноцитов во многом предопределяет возможности колонизации микрофлоры толстой кишки, ее жизнедеятельность и состав [3, 8].

В динамике изучали состояние микрофлоры толстой кишки, определяли количественный и качественный состав облигатной и факультативной флоры. Забор кала проводился утром в стерильную посуду и в течение 45 минут доставлялся в микробиологическую лабораторию. Определяли количество бифидобактерий, лактобацилл, кишечной палочки с исследованием ее ферментативных свойств, изучали количественный и качественный состав факультативной флоры с исследованием количества стафилококков и их ферментативных свойств, стрепто- и энтерококков, клостридий, клебсиелл, протея, энтеробактера, цитобактера, грибов рода Candida.

Все обследованные в качестве базисной терапии получали месалазин в дозе 4,0 г в сутки в течение 28 дней. Эндоскопические, морфологические и микробиологические исследования проводились у больных НЯК до начала терапии и после ее окончания.

Результаты. Клиника НЯК была типичной и характеризовалась нарушениями стула: поносами до 20 раз в день с примесью крови и слизи, тенезмами, ночными дефекациями, вздутиями кишечника, болевым, астеноневротическим синдромами. Среди обследованных у 36 (60,0 %) выявлено среднетяжелое течение НЯК, а у 24 (40,0 %) диагностировано легкое течение НЯК. Для оценки динамики состояния больных и определения эффективности проводимой терапии у пациентов определяли активность заболевания по индексу клинической активности. Индекс высчитывали в баллах [10]. У обследованных больных НЯК он составил 10,54 ± 0,91 балла. При эндоскопическом исследовании у всех больных НЯК до терапии выявляли гиперемию слизистой оболочки толстой кишки с изменением сосудистого рисунка, отечность слизистой толстой кишки с «зернистостью» — грануляциями мембранной поверхности слизистой оболочки, рассеивающими отраженный свет. Эрозии или язвы, повышенная ранимость слизистой оболочки толстой кишки, примеси слизи, фибрина, гноя обнаружены практически у всех пациентов, и степень выраженности этих изменений коррелировала со степенью тяжести НЯК.

Для объективизации динамической оценки эндоскопических изменений слизистой оболочки толстой кишки у больных НЯК было проведено определение эндоскопического индекса, который включал наличие грануляций мембранной поверхности слизистой оболочки, рассеивающих отраженный свет, изменений сосудистого рисунка, ранимость и контактную кровоточивость, поражения слизистой оболочки (эрозии, язвы, фибрин, слизь) и высчитывался в баллах [13]. Эндоскопический индекс в целом по группе больных НЯК до терапии составил 7,2 ± 0,7 балла.

До лечения у всех обследуемых выявлено снижение числа бокаловидных клеток, но степень их уменьшения коррелировала с тяжестью НЯК и варьировала от незначительного уменьшения количества бокаловидных клеток с преобладанием клеток с мелкими, незрелыми вакуолями у больных НЯК при легкой степени до выраженного снижения и иногда полного отсутствия бокаловидных клеток у пациентов со среднетяжелым течением НЯК. Установлено истончение, дистрофия поверхностного эпителия с перестройкой крипт, кроме того, у всех больных обнаружены дефекты поверхностного эпителия — от микроэрозий до глубоких язв, заполненных некротическими массами. На этом фоне у всех пациентов выявлена усиленная воспалительная клеточная инфильтрация слизистой оболочки толстой кишки, интенсивность которой колебалась от умеренной до выраженной.

В воспалительном клеточном инфильтрате у больных НЯК чаще преобладали лимфоциты — у 48 (80,0 %) больных, плазмоциты — у 36 (60,0 %), макрофаги — у 28 (46,7 %) пациентов. Нейтрофилы обнаруживались в инфильтрате у 36 (60,0 %) больных НЯК, при этом активные сегменто­ядерные лейкоциты, содержащие гликоген, обнаружены у 26 (43,3 %) обследуемых. Более чем у половины больных НЯК выявлялись внутриэпителиальные лимфоциты, что может быть маркером активности процесса.

Помимо изменений клеточного состава слизистой оболочки толстой кишки у больных НЯК выявлены нарушения слизеобразования. У всех обнаружено уменьшение количества внутриклеточной и внеклеточной слизи с изменением ее свойств. При проведении PAS-реакции, окрашивания альциановым синим рН 2,5 и рН 1,0, лектинами интенсивность окрашивания у всех больных НЯК была ниже нормы (P < 0,01), что свидетельствует об изменениях состава толстокишечной слизи, уменьшении в ней гликозаминогликанов и гликопротеинов. Количество N-ацетилнейраминовой кислоты, сиаловых кислот (окраска WGA) у больных левосторонним НЯК было снижено. При снижении общего количества галактозы (окраска PNA и ML-1) выявлялись модификации ее изомеров. Если количество b-D-галактозы по мере роста степени тяжести НЯК достоверно снижалось (окраска PNA), то уровень a-D-галактозы (окраска ML-1) у больных с различной степенью тяжести НЯК достоверно не отличался. Количество галактозамина и фукозы (окраска SBA SNA и LAL) было достоверно снижено у всех обследованных. Отмечался минимальный уровень маннозы (окраска LCA) у пациентов с левосторонним НЯК средней тяжести, а у больных с легким течением НЯК снижался незначительно. В то же время уровни глюкозы и глюкозамина (окраска HPA) существенно не изменялись у больных с различной степенью тяжести НЯК.

На фоне изменения количества толстокишечной слизи, ее свойств отмечено нарушение микробного пейзажа толстой кишки у больных НЯК до терапии. Патогенные микроорганизмы не были выделены ни у одного пациента, а облигатная флора — бифидобактерии, лактобациллы и кишечная палочка — высевалась почти у всех больных (96,7; 96,7; 100,0% соответственно). В целом по группе больных НЯК бифидобактерии и лактобациллы высевались реже, чем у здоровых, при этом их количество и удельный вес были достоверно снижены. У обследованных с НЯК при снижении количества кишечной палочки отмечалось повышение ее удельного веса (20,5 ± 2,0 % у больных НЯК и 16,6 ± 1,8 % у здоровых (P < 0,05)), а также модификация ее ферментативных свойств с увеличением количества штаммов со сниженной ферментативной активностью и гемолизирующих форм E.coli. Энтерококки, которые высевались у всех здоровых людей, выделены лишь у 26 (43,3 %) больных НЯК (P < 0,01). Чаще всего высевались энтерококки видов E.faecalis, E.aerogenes. Количество и удельный вес энтерококков в общей бактериальной популяции достоверно не изменялись. Снижение количества облигатной флоры приводило к понижению колонизационной резистентности и росту факультативных бактерий. Энтеробактер у пациентов с НЯК высевался достоверно чаще, чем у здоровых (40,08 и 24,00 % соответственно, P < 0,01), при этом его количество и удельный вес также достоверно превышали показатели здоровых лиц. Наиболее часто высевались E.agglomerans, E.gergoviae, E.sakazaki. Частота встречаемости стафилококков у больных НЯК была несколько выше, чем у здоровых, однако их количество и удельный вес у пациентов с НЯК достоверно не отличались. У больных НЯК, как и у здоровых лиц, чаще высевались S.epidermidis, S.aureus. Клебсиеллы высевались достоверно чаще у больных НЯК — 28 (46,7 %) пациентов, при этом их количество возрастало почти в 3,5 раза, а удельный вес — в 9,8 раза. Чаще всего у обследуемых с НЯК встречались K.oxyboca, K.pneumoniae. Частота высеваемости протея у больных НЯК была выше, чем у здоровых лиц, в 2,3 раза. Протей был выделен у 22 (36,7 %) пациентов с НЯК. Его количество было выше, чем у здоровых лиц, в 5,25 раза и составляло 2,52 ± 0,22 lg КОЕ/г при норме 0,48 ± 0,19 lg КОЕ/г (P < 0,001), при этом его удельный вес превышал норму в

14,5 раза (P < 0,001). Чаще у пациентов с НЯК высевался протей рода P.mirabilis. Количество цитобактера у больных НЯК достоверно превышало нормальные показатели (2,28 ± 0,22 lg КОЕ/г и 1,79 ± 0,32 lg КОЕ/г соответственно (P < 0,05)), а удельный вес был в 22 раза выше, чем у здоровых лиц (P < 0,0001). Грибы вида кандида у обследуемых с НЯК высевались с той же частотой, что и у здоровых лиц, а их количество и удельный вес соответствовали нормальным показателям.

Таким образом, у больных НЯК развивается дисбактериоз, который характеризуется снижением частоты встречаемости, количества и удельного веса облигатной флоры и увеличением факультативных бактерий. Дисбактериоз на фоне нарушения метаболизма клеток кишечного эпителия, изменения синтеза слизи и ее химизма способствует повышению проницаемости слизистого барьера толстой кишки, что приводит к усилению воспаления, развитию более распространенного процесса в толстом кишечнике и может способствовать формированию внекишечных проявлений.

На фоне терапии состояние больных достоверно улучшалось. На фоне 28-дневного лечения положительная клиническая динамика с улучшением самочувствия и уменьшением клинической симптоматики отмечена у всех больных НЯК. В то же время клиническая ремиссия НЯК выявлена у 54 (90,0 %) пациентов, а эндоскопическая — у 50 (83,3 %). На 16,9 ± 2,1 сут. у больных НЯК отмечено исчезновение болевого синдрома, тенезмов, ночного стула. В то же время нормализация частоты стула, исчезновение примеси крови и слизи в кале, вздутия и урчания кишечника наблюдались только у пациентов на фоне достижения полной клинической ремиссии. В целом по группе больных НЯК после терапии индекс клинической активности составил 2,89 ± 0,31 балла, а эндоскопический индекс был 2,3 ± 0,3 балла, что может свидетельствовать о достаточно высокой эффективности проводимой терапии.

На фоне положительной клинической динамики у обследованных с НЯК отмечена тенденция к нормализации микробного пейзажа толстой кишки (табл. 1). На фоне терапии повышалось общее количество кишечной палочки, при этом уменьшалось количество кишечной палочки со сниженными ферментативными свойствами и гемолизирующих штаммов Е.coli. Число бифидобактерий и лактобацилл на фоне терапии достоверно не менялось. В то же время после лечения у больных НЯК отмечена тенденция к уменьшению количества факультативной флоры. При использовании месалазина выявлено достоверное снижение количества энтеробактера, протея и цитобактера (P < 0,05).

Следовательно, на фоне применения базисной терапии НЯК с включением месалазина отмечается тенденция к нормализации микробного пейзажа толстой кишки с увеличением количества кишечной палочки, с нормализацией ее ферментативных свойств, уменьшением количества энтеробактера, протея, цитобактера. Возможно, это связано с улучшением метаболизма слизистой оболочки толстого кишечника и тенденцией к нормализации слизеобразования в толстой кишке.

После лечения у всех пациентов выявлена положительная гистологическая динамика, которая выражалась в снижении интенсивности клеточной инфильтрации слизистой оболочки толстой кишки. Гистологическая ремиссия выявлена у 48 (80,0 %) больных НЯК. Следует отметить, что у 12 (20,0 %) обследованных с НЯК, у которых выявлялись сегментоядерные лейкоциты в клеточном инфильтрате до лечения, эти клетки обнаруживались и после терапии. В то же время после лечения сегментоядерные лейкоциты, обнаруживаемые в слизистой оболочке толстой кишки, не содержали гликоген, что свидетельствует об отсутствии местной воспалительной активности. После лечения число бокаловидных клеток увеличивалось, они содержали более зрелую слизь. У 20 (33,3 %) больных НЯК выявлялось нормальное количество бокаловидных клеток, содержащих зрелую слизь. Почти у всех больных выявлено повышение интенсивности окрашивания при проведении PAS-реакции и методики с альциановым синим, особенно при pH 2,5. Это свидетельствует о нормализации процессов слизеобразования и нормальном соотношении сульфатированных и несульфатированных гликозаминогликанов в кишечной слизи.

Количество отдельных моносахаридов слизи у больных после терапии повышалось (табл. 2). Количество галактозы (окраска PNA и ML-1), уровень глюкозы и глюкозамина (окраска HPA) достоверно возрастали, но уровень галактозамина, фукозы, маннозы слизи (окраска SNA, LAL, LCA) увеличивался недостоверно. Полной нормализации слизеобразования у больных НЯК не наблюдалось, поэтому им было рекомендовано продолжить прием месалазина для поддержания ремиссии. Улучшение слизеобразования на фоне применения месалазина у больных НЯК способствовало более стабильной и длительной ремиссии. Если у пациентов, не принимавших поддерживающую дозу препарата, ремиссия длилась 9,2 ± 1,1 месяца, то у больных, получавших месалазин в ремиссии, продолжительность ее составляла 14,1 ± 1,4 месяца (P < 0,05).

Таким образом, применение месалазина является эффективным у больных НЯК. Его использование оказывает не только выраженный противовоспалительный, но и цитопротективный эффект, приводит к нормализации процессов слизеобразования, стимулирует продукцию слизи, способствует ее созреванию, что, возможно, обусловливает нормализацию количества и ферментативных свойств кишечной палочки и тенденцию к уменьшению количества факультативной флоры. Это способствует более стабильной и длительной ремиссии НЯК у таких больных.