Журнал «Здоровье ребенка» 6(21) 2009

Лечение критических состояний у детей остается сложной проблемой современной интенсивной медицины, что обусловлено высокой частотой развития синдрома полиорганной недостаточности и сохранением высокой летальности. Летальность при септическом шоке у детей при отсутствии квалифицированной помощи может достигать 80 % [1].

В последние годы очень активно изучается эндо­токсин грамотрицательной инфекции в инициации септического процесса. Так, связывание эндотокси­на с липополисахарид-связывающим белком (lipopoly­saccharide binding protein, LBP), который обладает вы­соким аффинитетом к липиду А и опосредует взаимо­действие эндотоксина с мембраносвязывающим рецеп­то­ром CD14 и TLR4 (toll-like receptor 4) на клетках моно­цитарно-макрофагального ряда, потенцирует выработку этими клетками провоспалительных цитокинов [2, 3].

Во многих исследованиях показано, что эндотелиальные клетки испытывают недостаток в mCD14 и отвечают на эндотоксин прежде всего через растворимую форму (sCD14) этого рецептора [4].

Таким образом, к гуморальным неспецифическим механизмам индукции антиэндотоксинового иммунитета можно отнести LBP и sCD14.

К гуморальным механизмам деактивации эндотоксина можно отнести естественные антиэндотоксиновые антитела. Известно, что важную роль в клиренсе липополисахарида как непосредственно в слизистых, так и в кровотоке играют антиэндотоксиновые антитела (анти-ЭТ-АТ). Более того, антитела к консервативным частям молекулы ЭТ можно рассматривать как универсальный интегральный маркер, одновременно отражающий реакцию организма на поступление ЭТ и характеризующий врожденный и приобретенный иммунитет к грамотрицательным микроорганизмам [5, 6].

Целесообразность включения внутривенных иммуноглобулинов в терапию при тяжелом сепсисе (IgG и IgG + IgM) связана с их возможностью ограничивать избыточное действие провоспалительных цитокинов, повышать клиренс эндотоксина, устранять анергию, усиливать эффект бета-лактамных антибиотиков. Использование внутривенных иммуноглобулинов в рамках иммунозаместительной терапии тяжелого сепсиса и септического шока является в настоящее время единственным реально доказанным методом иммунокоррекции при сепсисе, повышающим выживаемость [7–11].

В литературе практически не раскрыты механизмы влияния специфической пассивной иммунокоррекции с использованием плазмы доноров, обогащенной антителами к эндотоксину, на состояние антиэндотоксинового иммунитета у детей с грам­отрицательным септическим шоком и тяжелым сепсисом.

В связи с этим целью нашей работы стало изучение влияния патогенетической иммунокоррекции на состояние антиэндотоксинового иммунитета у детей с септическим шоком и тяжелым сепсисом, вызванных грамотрицательной флорой.

Материалы и методы

Для изучения влияния патогенетической иммунокоррекции на состояние антиэндотоксинового иммунитета при септическом шоке и тяжелом сепсисе, вызванными грамотрицательной флорой, проведено исследование у 12 детей, госпитализированных в хирургическое отделение Республиканской детской клинической больницы г. Симферополя.

В соответствии с клиническими диагнозами было исследовано 5 детей с острым гематогенным остеомиелитом, 7 — с перитонитом.

Для проведения патогенетической иммунокоррекции все пациенты были разделены путем случайной выборки на 2 группы. В 1-ю группу (метод 1) вошли 6 детей, у которых проводилась патогенетическая иммунокоррекция с использованием плазмы доноров, обогащенной антителами к эндотоксину; во 2-ю группу (метод 2) — 6 детей, у которых проводилось комплексное лечение без иммунокоррекции.

Комплексное лечение включало: хирургические пособия, антибактериальную терапию, интенсивную терапию, реабилитацию.

Иммунокоррекция проводилась на 2–3-е сутки с использованием регионального банка плазмы постоянных доноров, обогащенной антителами к эндотоксину. Заготовка, транспортирование и методы введения плазмы соответствовали рекомендациям МЗ Украины и Академии медицинских наук Украины.

Контрольную группу составили 110 условно здоровых детей того же возраста и пола.

Для определения септического шока была использована классификация, принятая на конференции IPSSC в 2005 г. [12].

J.A. Carcillo с коллегами определили септический шок в педиатрии как тахикардию (которая может отсутствовать у пациентов с гипотермией) с признаками пониженной перфузии (снижение периферического пульса по сравнению с центральным, время капиллярного наполнения более 2 секунд, влажные и холодные конечности, сниженный диурез) [13]. У детей гипотензия является признаком позднего, декомпенсированного шока. Она хоть и не имеет значения в определении, но подтверждает состояние шока, если присутствует у ребенка с подозреваемой или доказанной инфекцией.

Уровни антиэндотоксиновых антител классов А, М, G (соответственно анти-ЭТ-IgA, анти-ЭТ-IgM и анти-ЭТ-IgG) определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа [14]. В качестве антигена использовали липополисахарид грам­отрицательной энтеробактерии Escherichia coli K30 (O9:K30:H12), выделенной из бактериальной биомассы методом водно-фенольной экстракции и дополнительно очищенной от примесей РНК обработкой цетавлоном (Serva, Германия). Уровни анти-ЭТ-IgA, анти-ЭТ-IgM и анти-ЭТ-IgG выражали в условных единицах оптической плотности конечного продукта ферментативной реакции для разведения тестируемой сыворотки крови 1 : 50 (для анти-ЭТ-IgA, анти-ЭТ-IgM) и 1 : 200 для анти-ЭТ-IgG.

Для исследования LBP и sCD14 использовали тест-системы Hbt Human LBP ELISA Kit, Product Number: HK315 и Hbt Human sCD14 ELISA Kit, Product Number: HK320 производства Hycult biotechnology (Голландия). Образцы и стандартные растворы инкубировали в титрационном микропланшете покрытыми антителами против LBP или sCD14. Во время инкубации LBP или sCD14 связывались с антителами, несвязанный материал извлекался вымыванием. Биотинилированные вторые антитела к LBP или sCD14 добавлялись в микропланшеты, после чего проводили вторичную отмывку. Стрептавидин-пероксидазный конъюгат добавляли в образцы, после чего остаток удаляли повторным вымыванием, останавливали реакцию добавлением лимонной кислоты. Оптическую плотность определяли на анализаторе StatFox 2100 на длине волны 450 нм [15]. Содержание LBP и sCD14 выражали в мкг/мл.

Все полученные результаты подвергнуты статистической обработке для параметрических и непараметрических критериев с использованием программы MedStat (серийный № MS0011) ДНПП ООО «Аль­фа», г. Донецк.

При анализе для проверки распределения на нормальность использовали Хи-квадрат и критерий W Шапиро — Уилка, сравнение центральных тенденций двух независимых выборок с использованием W-критерия Вилкоксона и сравнение средних двух независимых выборок по критерию Стьюдента. Для множественного сравнения использовали ранговый однофакторный анализ Крускала — Уоллиса и критерий Данна [16].

Результаты и их обсуждение

Анализ динамики показателей антиэндотоксинового иммунитета у детей с септическим шоком и тяжелым сепсисом представлен в табл. 1.

При анализе этих показателей на 1-е сутки (табл. 1) были выявлены следующие закономерности: уровень анти-ЭТ-IgG был достоверно ниже (Р < 0,01) контроля для групп с методом 1, 2; в свою очередь, уровни анти-ЭТ-IgM, анти-ЭТ-IgA, LBP и sCD14 были достоверно выше (Р < 0,01) контроля. Следует отметить, что исследуемые показатели на 1-е сутки достоверно не отличались между группами с методом лечения 1, 2.

Анализируя данные, полученные на 1-е сутки, можно утверждать, что тяжелый сепсис и септический шок приводят к резкой девиации антиэндотоксинового иммунитета, которая проявляется, с одной стороны, иммунодефицитом специфических анти-ЭТ-IgG и возрастанием первичных (низкоаффинных) анти-ЭТ-IgM, с другой стороны, чрезмерной активацией неспецифических компонентов LBP и sCD14. Наблюдаемое возрастание уровней анти-ЭТ-IgA для групп с методом лечения 1, 2 является, очевидно, генетически детерминированным процессом или возможностью использования гуморальных форм анти-ЭТ-IgA для образования секреторных, которые выполняют важную роль в протекции проникновения эндотоксина через слизистые барьеры.

На 7-е сутки показатели антиэндотоксинового иммунитета (табл. 1), для групп с методом лечения 1, 2 по отношению к контролю сохранили статистические связи, установленные на 1-е сутки. Однако для метода лечения 1 по сравнению с методом 2 были установлены совершенно новые закономерности: уровень анти-ЭТ-IgG для метода 1 был достоверно выше (Р < 0,01) по сравнению с методом 2; а уровень sCD14 достоверно ниже (Р < 0,01) при аналогичном сравнении.

Заключительным этапом работы стал анализ данных показателей на 14-е сутки (табл. 1). По отношению к контролю для групп с методом лечения 1, 2 все показатели антиэндотоксинового иммунитета сохранили статистические связи, установленные на 1-е, 7-е сутки. Установленное возрастание уровня анти-ЭТ-IgG на 7 сутки (0,167 ± 0,013) было еще более ярко выраженным на 14-е сутки (0,249 ± 0,015) для группы с методом 1. Уровень анти-ЭТ-IgA для группы с методом 1 достоверно снижался (Р < 0,01) по сравнению с группой метода 2. Значения показателей неспецифического, адаптивного антиэндотоксинового иммунитета LBP и sCD14 в группе детей с методом 1 (использование плазмы доноров, обогащенной антителами к эндотоксину) на 14-е сутки резко снижаются по сравнению с группой метода 2 (комплексное лечение без иммунокоррекции).

Таким образом, установленный факт девиации иммунного ответа на эндотоксин при грамотрицательном септическом шоке и тяжелом сепсисе на первые сутки значительно нивелируется при использовании иммунокоррекции на 7-е, 14-е сутки.

Выводы

1. Тяжелый сепсис и септический шок при грам­отрицательной инфекции приводят к резкой девиации антиэндотоксинового иммунитета, которая проявляется иммунодефицитом специфических анти-ЭТ-IgG и возрастанием первичных (низкоаффинных) анти-ЭТ-IgM в ассоциации с чрезмерной активацией неспецифических компонентов LBP и sCD14.

2. В группе детей, которым проводилась иммунокоррекция плазмой доноров, обогащенной антителами к эндотоксину, на 7-е сутки наблюдается положительная динамика показателей, характеризующаяся повышением анти-ЭТ-IgG и снижением sCD14 с последующим повышением анти-ЭТ-IgG и снижением анти-ЭТ-IgА, sCD14 и LBP на 14-е сутки.

Перспективы дальнейших исследований. С учетом полученных данных о реагировании антиэндотоксинового иммунитета и влияния иммунокоррекции с использованием плазмы доноров, обогащенной антителами к эндотоксину, у детей с септическим шоком и тяжелым сепсисом планируется изучение  клинической эффективности данного метода лечения.