Журнал «Боль. Суставы. Позвоночник» 1 (05) 2012

На сегодняшний день более 85 % людей во всем мире страдают от болей в спине [1], одной из причин которых может быть дегенерация межпозвоночного диска [2]. До сих пор неизвестны факторы, вызывающие дегенерацию межпозвоночного диска, что делает необходимым продолжение исследований, связанных с изучением влияния экзогенных и эндогенных факторов на позвоночный столб в целом и межпозвоночный диск в частности. Одним из таких экзогенных факторов может быть влияние различных вредных веществ, попадающих из окружающей среды в организм человека, а именно свинца. Согласно данным ВОЗ, на 2010 г. в Украине 68,8 % населения проживает в городах, что может предполагать угрозу влияния на их организм соединений свинца, поступающего в воздух и воду от промышленных объектов и автотранспорта [3]. Как известно, свинец в организме человека соединяется с белками эритроцитов и может циркулировать в таком виде в кровотоке до 30 дней [4]. Влияние свинца на мышечную, кровеносную и нервную системы, внутренние органы, длинные кости широко исследовано. Имеются данные об особенностях организации зон роста в условиях свинцовой интоксикации. Следует отметить, что дети более чувствительны к воздействию свинца, так как при поглощении 40 % дозы в их организме накапливается до 30 % свинца, в то время как у взрослых людей процент поглощения более низкий — до 10 %, а накопление составляет около 1 % [5]. Имеются данные, что у детей свинец кумулируется в мягких тканях в большей мере, чем у взрослых, создавая таким образом среду для развития различных нарушений уже в молодом возрасте [6]. Однако данных, касающихся воздействия свинцовой интоксикации на позвоночный столб, практически не имеется.

Межпозвоночный диск как составная часть three-joint complех позвоночного столба является аваскулярной структурой, и его питание происходит у человека диффузионным путем через замыкательную пластинку из прилежащих кровеносных сосудов, а у мелких животных, в том числе у крыс, — непосредственно через внешние отделы фиброзного кольца [7, 8]. Представляется возможным, что свинец может проникать в диск путем диффузии из кровотока вместе с питательными веществами и оказывать влияние на его структуру и функции.

Цель исследования — изучить влияние свинцовой интоксикации на межпозвоночный диск крыс.

Объект и методы исследования

Экспериментальное исследование было проведено на 15 белых лабораторных крысах-самцах в возрасте 1,5 месяца популяции экспериментально-биологической клиники ГУ «Институт патологии позвоночника и суставов им. проф. М.И. Ситенко НАМН Украины». Животные были отобраны и случайным образом разделены на 2 группы: 1) модели свинцовой интоксикации (опытная группа) — 9 крыс; 2) контрольная — 6 крыс.

Для исследования использовали модель свинцовой интоксикации, которая имитировала влияние свинца на организм человека в условиях проживания в мегаполисе [9]. При этом животные получали раствор ацетата свинца с элементарным содержанием свинца 230 мг/л в качестве питьевой воды, а контрольная группа — дистиллированную воду. Эксперимент длился 3 месяца, после чего животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом согласно международным нормативам по биоэтике [10].

Для дальнейшего анализа были взяты поясничные отделы позвоночников, которые обрабатывали согласно стандартной гистологической методике [11]. Материал фиксировали в растворе с массовой частью нейтрального формалина 10 %, проводили декальцинацию в растворе с массовой частью азотной кислоты 4 %, обезвоживали в водных растворах этилового спирта возрастающей концентрации, а также в смеси этилового спирта с диэтиловым эфиром (раствор 1 : 1), заключали в целлоидин.

Гистологические срезы изготовляли на санном микротоме МС-2. С каждого препарата изготовляли по 3 среза толщиной 10–15 мкм. Полученные срезы окрашивали гематоксилином и эозином [11]. Исследование полученных гистологических препаратов проводили с помощью светового микроскопа Axiostar Plus.

Для электронно-микроскопического исследования фрагменты межпозвоночного диска лабораторных крыс размером 1 мм³ префиксировали в фиксаторе Карновского с последующей фиксацией в 1% растворе четырехокиси осмия. Фрагменты обезвоживали в серии спиртов восходящей концентрации, ацетоне, пропитывали в смеси ацетона с эпоксидной смолой, заключали в смесь эпона с аралдитом [12]. Ультратонкие срезы толщиной 40–50 нм контрастировали уранилацетатом и красителем Рейнольдса [13] и исследовали с помощью трансмиссионного электронного микроскопа ЕМВ-100БР.

Фотографии препаратов изготовляли при помощи цифровой камеры Canon EOS 300D.

Для гистоморфометрического анализа использовали компьютерную программу ImageJ 1.45. Цифровые показатели были обработаны статистически.

Результаты и их обсуждение

Контрольная группа

При гистологическом анализе межпозвоночного диска крыс контрольной группы выявлено, что в фиброзном кольце упорядоченно располагались пластинки из пучков коллагеновых волокон, а студенистое ядро было представлено синцитиеподобной структурой, в которой нотохордальные клетки тесно контактировали между собой отростками. Клетки фиброзного кольца и студенистого ядра имели слабобазофильную окраску.

При электронно-микроскопическом анализе было обнаружено, что во внешних отделах фиброзного кольца располагались фиброхондроциты, которые во внутренних отделах диска имели фенотипические признаки, характерные для хондроцитов, то есть располагались в капсулах. Клетки фиброзного кольца имели ядра с преобладанием эухроматина, в цитоплазме обнаруживалась развитая гранулярная эндоплазматическая сеть, что свидетельствовало об их функциональной активности.

Модель свинцовой интоксикации

В результате гистологического анализа у животных опытной группы в фиброзном кольце были обнаружены проявления дегенеративных изменений. При этом во внешнем отделе фиброзного кольца происходило растрескивание пластин между пучками коллагеновых волокон, наблюдался их дискоидный распад, а также встречались очаги некротически измененного матрикса (рис. 1).

Во внутреннем отделе фиброзного кольца наблюдалось разрастание хрящевой ткани по направлению к студенистому ядру. Ткань, замещающая студенистое ядро, имела структуру, характерную для гиалинового хряща. Встречались изогенные группы по 5-8 хондроцитов, матрикс имел слабоэозинофильную окраску, волокнистые структуры не имели четких контуров. Клетки в таких изогенных группах находились в разном биотическом состоянии, а именно: некоторые из них имели пикнотические ядра или вакуолизированную цитоплазму, в то время как другие — крупные гипохромные ядра, также обнаруживались очаги детрита (рис. 2). Выявлены участки с нарушением пластинчатой структуры фиброзного кольца — при этом изменялась пространственная ориентация пластинок, в матриксе которых хаотично располагались фиброхондроциты (рис. 3).

В студенистом ядре животных опытной группы синцитиеподобная структура была нарушена, обнаруживались изолированные скопления клеток (рис. 2, 3).

Электронно-микроскопический анализ показал, что в студенистом ядре у животных обеих групп нотохордальные клетки имели ядра различной степени гетерохроматизации, в цитоплазме располагались крупные вакуоли и лизосомы различных размеров (рис. 4, 5).

Для изучения влияния свинцовой интоксикации на клеточную популяцию фиброзного кольца была проведена гистоморфометрия внешнего отдела, по данным которой выявлено, что плотность клеток у животных опытной группы была в 1,3 раза ниже (p < 0,05) по сравнению с контролем. Снижение плотности клеток может быть вызвано деструктивными нарушениями в матриксе фиброзного кольца или снижением адгезивных качеств клеток [14].

При электронно-микроскопическом анализе у крыс опытной группы в матриксе внешнего отдела фиброзного кольца были обнаружены фиброхондроциты, в цитоплазме которых преобладали микрофиламенты и имела место вакуолизация, что свидетельствует о низкой биосинтетической активности клеток (рис. 6). Коллагеновые волокна имели размытые контуры, большинство волокон не имели поперечной исчерченности, что указывает на деструкцию на участках. В местах неравномерной исчерченности волокон обнаруживались электронно-плотные участки, возможно связанные с кальцификацией или с накоплением свинца в матриксе (рис. 7). Аналогичные изменения наблюдались и при изучении другой хрящевой ткани — суставного хряща [15].

Во внутреннем отделе фиброзного кольца в опытной группе встречались хондроциты с двумя ядрами, контуры которых соответствовали как «ключ замку», что может свидетельствовать о недавнем делении амитозом этих клеток. Цитоплазма у таких клеток была слабо дифференцирована (рис. 8). Присутствие таких клеток подтверждает наличие процесса гиалинизации фиброзного кольца, обнаруженного при гистологическом анализе.

У многих клеток фиброзного кольца при интоксикации свинцом в цитоплазме находились деструктивные полости различного размера и локализации, а также электронно-плотные включения. Ядра в таких клетках имели небольшие размеры с повышенной гетерохроматизацией, плотность ядерных пор была низкой, что свидетельствует о нарушении обменных процессов между ядром и цитоплазмой (рис. 9).

Выводы

1. При свинцовой интоксикации возникают дегенеративные нарушения во всех отделах межпозвоночного диска крыс, поражающие структуру как фиброзного кольца, так и студенистого ядра.

2. Дегенеративные изменения фиброзного кольца связаны с нарушением слоистости вследствие появления трещин в пластинах и между ними, исчерченности коллагеновых волокон, снижением плотности фиброхондроцитов.

3. Во внутреннем отделе фиброзного кольца зафиксирована гиалинизация, что выражается в повышении плотности хондроцитов и образовании ими крупных изогенных групп.

4. В студенистом ядре имело место нарушение синцитиеподобной структуры, проявляющееся в формировании отдельных скоплений нотохордальных клеток, не связанных между собой.