Газета «Новости медицины и фармации» 5(209) 2007

В последнее время отмечается значительный рост сосудистых заболеваний головного мозга. Ежегодно в мире переносят инсульт около 6 млн человек, из них 4,7 млн умирают. В большинстве стран инсульт занимает 2–3-е место в структуре общей смертности населения, уступая лишь злокачественным новообразованиям и кардиоваскулярной патологии. Таким образом, лечение мозгового инсульта является одной из актуальных задач современной медицины [3].

Наиболее интенсивно поиск препаратов церебропротективного действия ведется среди антагонистов кальциевых каналов L‑типа, блокаторов фенциклидинового и глутаминового сайтов NMDA-рецепторов, позитивных модуляторов AMPA-рецепторов, агонистов ГАМК-рецепторов, веществ, нормализующих биоэнергетические процессы в нейроне, и антиоксидантов [3, 5, 6].

Целью настоящей работы явилась оценка влияния тиотриазолина и пирацетама на изменение морфологических показателей повреждений нейронов коры лобной доли и гиппокампа у крыс с ОНМК по типу ишемического инсульта.

Материалы и методы исследования

Эксперименты выполнены на крысах линии Вистар обоих полов массой 250–270 г, полученных из питомника ИФТ АМН Украины, в осенне-зимний период. Животные содержались в индивидуальных клетках в условиях 14-часового светового цикла при температуре 20–22 °C на стандартном рационе вивария.

Двустороннюю перевязку общих сонных артерий выполняли под этаминал-натриевым наркозом (40 мг/кг) с использованием хирургического доступа путем выделения сонных артерий и одномоментного наложения на них шелковой лигатуры [17].

Животные были разделены на 3 группы: I — животные с инсультом (контрольная группа); II — животные с инсультом, получавшие пирацетам; III — животные с инсультом, получавшие тиотриазолин. В каждой экспериментальной группе было по 10 животных, а в контрольной — 20. Изучаемые препараты вводили внутрибрюшинно через 12 часов после операции один раз в сутки в течение 4 дней: пирацетам (АО «Галычфарм») — 250 мг/кг, тиотриазолин (АО «Галычфарм») — 50 мг/кг.

Животные были забиты спустя 96 часов после окклюзии (на 4-е сутки) под этаминал-натриевым наркозом (40 мг/кг) и перфузированы ледяным фосфатным буфером через восходящую аорту в течение 5 мин. Мозг быстро извлекали и помещали на сутки в фиксатор Карнуа [16]. После стандартной гистологической проводки ткань заключали в парафин [16].

Для изучения морфологии нейронов на ротационном микротоме изготавливали 4‑микронные срезы пирамидного слоя нейронов сенсомоторной зоны фронтальной коры и гиппокампа, которые депарафинировали и окрашивали для определения содержания нуклеиновых кислот галлоцианин-хромовыми квасцами по Эйнарсону [5]. Морфометрические исследования проводили на микроскопе Axioskop («Zeiss», Германия). Изображения нейронов в области зоны CA1 гиппокампа (структура, отвечающая за механизмы памяти, наиболее чувствительная к ишемии зона коры головного мозга) и пирамидного слоя в лобной коре (ассоциативные нейроны), получаемые на микроскопе, с помощью высокочувствительной видеокамеры COHU-4922 («COHU Inc.», США) вводили в компьютерную программно-аппаратную систему цифрового анализа изображения DIAS, разработанную в ЗГМУ под руководством проф. Ю.М. Колесника [16]. Анализ изображений проводили в полуавтоматическом режиме. Дегенерирующими считались нейроны, имеющие признаки кариопикноза, кариорексиса или цитолиза. При анализе в качестве выживших подсчитывались лишь те нейроны, которые в площади среза содержали ядрышко. Программно измерялись плотность расположения выживших и дегенерирующих нейронов, соотношение числа интактных нейронов к гибнущим (индекс нейродегенерации) и отношение плотности выживших нейронов при использовании препарата к плотности интактных нейронов в контрольной группе (индекс улучшения выживаемости). Так как часть погибших нейронов к моменту гистологического исследования уже была фагоцитирована клетками микроглии, отдельно оценивался индекс относительной активности микроглии, равный частному от деления разности в плотности выживших нейронов на разность в плотности дегенерирующих нейронов (разность между группой контроля и соответствующего фармакологического препарата). Величина индекса нейродегенерации менее единицы свидетельствовала о преобладании числа гибнущих нейронов над выжившими; индексы улучшения выживаемости и активности микроглии более единицы свидетельствовали о позитивном действии фармакологического препарата, менее единицы — о негативном. О функциональном состоянии выживших нейронов судили на основании изменения площади ядер и ядрышек нейронов, содержания в них нуклеиновых кислот, ядерно-цитоплазматического соотношения и количества многоядрышковых клеток.

Полученные данные имели нормальное распределение. Отличия между группами оценивали статистически с использованием t-критерия Стьюдента. Достоверность отличий относительных величин оценивалась с применением критерия χ². Достоверными считали отличия с уровнем значимости более 95 % (p < 0,05).

Результаты и обсуждение

У животных контрольной группы, перенесших ишемический инсульт в результате двусторонней необратимой окклюзии общих сонных артерий, на четвертые сутки наблюдалось четырехкратное преобладание количества дегенерирующих пирамидных нейронов над выжившими в сенсомоторной зоне фронтальной коры и практически двукратное — в СА1 зоне гиппокампа (табл. 1). При этом в сенсомоторной зоне фронтальной коры гибель нейронов с одинаковой вероятностью происходила как с проявлением морфологических признаков кариопикноза, кариорексиса и цитопикноза, так и с проявлениями цитолиза (рис. 1А). С другой стороны, в гиппокампе в два раза чаще наблюдался цитолитический тип гибели нервных клеток (табл. 1). Мы предполагаем, что морфологические признаки цитолиза свидетельствуют о глубоком повреждении мембранного аппарата клеток — в первую очередь из-за избыточной продукции свободнорадикальных соединений на фоне глубокого энергетического дефицита.

Использование пирацетама приводило к значительному усилению процессов нейродегенерации в сенсомоторной зоне лобной коры: в пирамидном слое визуализировались лишь единичные выжившие нейроны; большая часть клеток была представлена пикнотическими клетками (рис. 1В). При этом величина индекса выживаемости была снижена в 25 раз, а индекса относительной активности микроглии — в 3 раза (табл. 1). Еще более сильное ишемическое повреждение в этой группе животных испытывала ткань гиппокампа: у всех крыс гиппокамп на всем своем протяжении был полностью разрушен — на его месте наблюдалась киста (рис. 1Г). Таким образом, пирацетам в острый период мозгового инсульта обладает негативным действием, так как, влияя на исключительно анаэробное окисление, способен усиливать явления лактат-ацидоза и тем самым ухудшать общую картину ишемии мозга, что в целом подтверждается результатами биохимических экспериментальных и клинических исследований [7, 9, 12, 18].

Тиотриазолин обладал значительным нейропротекторным действием (табл. 1). Так, тиотриазолин в 2 раза ослаблял процессы нейрональной гибели в сенсомоторной зоне фронтальной коры; и в 1,8 раза — для пирамидных нейронов СА1 зоны гиппокампа (табл. 1).

Причиной этого могло служить то, что механизм церебропротективного действия тиотриазолина в значительной степени обусловлен его антиоксидантным действием и связан со способностью оказывать активирующее действие на систему антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутаза и глутатионпероксидаза), способностью ингибировать АФК, а также его мембраностабилизирующим действием [9, 11, 13–15].

Тиотриазолин как в лобной коре, так и в гиппокампе практически оказывал влияние на элиминацию погибших нейронов, о чем свидетельствует величина индекса относительной активности микроглии (табл. 1), а пирацетам напротив, приводил к трехкратному снижению относительной функциональной активности микроглиальных фагоцитов в сенсомоторной зоне фронтальной коры.

Подтверждением значительных антиоксидантных свойств тиотриазолина служило снижение относительного количества случаев цитолиза нейронов в лобной коре, и особенно в гиппокампе (табл. 1).

При анализе морфологических показателей функциональной активности (табл. 2), которые позволяют давать оценку интенсивности процессов активации генов и синтеза белка [9, 12, 15, 18], было установлено, что применение тиотриазолина вызывало снижение доли функционально неактивного гетерохроматина в основном в ядрах нейронов гиппокампа. Это свидетельствовало о значительной стимуляции генной активности и об активации процессов трансляции. Подобным образом в ядрышках (местах продукции рибосомальной РНК) и цитоплазме нейронов при использовании тиотриазолина достоверно возрастала концентрация нуклеиновых кислот в гиппокампе, что свидетельствовало об усилении процессов синтеза белка вследствие активации трансляции мРНК на рибосомах (табл. 2).

Эти данные согласуются с нашими предыдущими работами, в которых показано, что тиотриазолин в острый период ишемического инсульта у животных с экспериментальной моделью ишемии приводит к нормализации многих показателей углеводно-энергетического обмена, гиперферментемии (ВВ-КФК) [1, 2, 4, 6–10], уменьшает степень выраженности ишемического повреждения головного мозга за счет позитивного влияния на аэробные пути выработки энергии. Кроме того, назначение тиотриазолина приводило к уменьшению активности реакций СРО, гиперпродукции NO и продуктов окислительной модификации белка, сопровождалось активацией АО-системы головного мозга [3, 6, 7, 9].

Тиотриазолин ослабляет развитие неврологического дефицита, ускоряет восстановление неврологического статуса, улучшает процессы обучения и памяти и снижает показатели гибели животных [1, 6, 7].

Выводы

1. Тиотриазолин обладает выраженным нейропротекторным действием в период острого мозгового инсульта. При этом тиотриазолин наиболее эффективен в отношении торможения нейрональной гибели в сенсомоторной зоне фронтальной коры, и особенно в зоне СА1 гиппокампа.

2. Ишемическая гибель нейронов в сенсомоторной зоне фронтальной коры с равной вероятностью происходит путем кариопикноза или цитолиза, в то время как в гиппокампе — преимущественно путем цитолиза. Тиотриазолин является мощным мембранопротектором, о чем свидетельствует значительное снижение частоты цитолиза в коре, и особенно в гиппокампе.

3. Использование пирацетама в острый период мозгового инсульта приводит к многократному усилению нейрональной гибели в различных зонах коры головного мозга вплоть до полного разрушения нервной ткани с образованием кист (в гиппокампе).

4. Тиотриазолин реализует свое нейропротекторное действие в гиппокампе на фоне увеличенной активности трансляционных и транскрипционных процессов, а в сенсомоторной зоне фронтальной коры вызывает нейропротекцию на фоне невыраженной транскрипционной и трансляционной активности.

Перспективным в направлении дальнейшего изучения терапевтического потенциала антиоксиданта тиотриазолина является выявление специфических генов, изменяющих свою активность под действием данного лекарственного средства и ответственных за наблюдаемое нейропротекторное действие.