Інформація призначена тільки для фахівців сфери охорони здоров'я, осіб,
які мають вищу або середню спеціальну медичну освіту.

Підтвердіть, що Ви є фахівцем у сфері охорони здоров'я.



СІМЕЙНІ ЛІКАРІ ТА ТЕРАПЕВТИ
день перший
день другий

АКУШЕРИ ГІНЕКОЛОГИ

КАРДІОЛОГИ, СІМЕЙНІ ЛІКАРІ, РЕВМАТОЛОГИ, НЕВРОЛОГИ, ЕНДОКРИНОЛОГИ

СТОМАТОЛОГИ

ІНФЕКЦІОНІСТИ, СІМЕЙНІ ЛІКАРІ, ПЕДІАТРИ, ГАСТРОЕНТЕРОЛОГИ, ГЕПАТОЛОГИ
день перший
день другий

ТРАВМАТОЛОГИ

ОНКОЛОГИ, (ОНКО-ГЕМАТОЛОГИ, ХІМІОТЕРАПЕВТИ, МАМОЛОГИ, ОНКО-ХІРУРГИ)

ЕНДОКРИНОЛОГИ, СІМЕЙНІ ЛІКАРІ, ПЕДІАТРИ, КАРДІОЛОГИ ТА ІНШІ СПЕЦІАЛІСТИ

ПЕДІАТРИ ТА СІМЕЙНІ ЛІКАРІ

АНЕСТЕЗІОЛОГИ, ХІРУРГИ

"Medical and social problems of family" 3-4 (том 17) 2012

Back to issue

Молекулярный цитогенетический анализ сперматозоидов у бесплодных мужчин методом флюоресцентной гибридизации

Authors: Шамраев С.Н. - Донецкий национальный медицинский университет им. М. Горького; Рутинский А.И. - Украинско-французский медицинский центр репродуктивных функций человека «Семь+Я»; Бабюк И.А. - Институт неотложной и восстановительной хирургии им. В.К. Гусака

Categories: Obstetrics and gynecology

Sections: Clinical researches

print version


Summary

В статье проанализированы результаты молекулярно-цитогенетического анализа ядер сперматозоидов методом FISH у 90 пациентов с бесплодием и у 10 условно здоровых фертильных мужчин. Количество пациентов с повышенным уровнем анеуплоидий сперматозоидов в основной группе составило 83,33 %. Средний уровень анеуплоидий в основной группе был 1,91 ± 0,40 % и достоверно превышал таковой в контроле (0,13 ± 0,02 %) в 14,69 раза. У 6,67 % пациентов с бесплодием был отмечен высокий уровень анеуплоидий (от 0,9 до 1,9 %) при нормальных показателях спермограммы. Проведение молекулярно-цитогенетического анализа спермы методом FISH позволяет выявить высокий уровень анеуплоидий ядер сперматозоидов у пациентов с нарушением фертильности. Использование данного метода диагностики показано всем парам, планирующим лечение методом ЭКО/ИКСИ, с целью прогнозирования генетических нарушений эмбрионов и дает возможность генетической селекции у пациентов с высоким уровнем анеуплоидий ядер сперматозоидов.


Keywords

Мужское бесплодие, патозооспермия, хромосомные аномалии, FISH.

В настоящее время большой интерес у специалистов, занимающихся проблемами бесплодия, вызывают генетические исследования. С одной стороны, это связано с прогрессирующим увеличением удельного веса мужского фактора. За последние 20 лет он изменился с 30 до 50 % и продолжает расти [1].

С другой стороны, среди причин мужской инфертильности довольно большой удельный вес (до 30 %) занимает так называемое идиопатическое бесплодие. Вместе с тем в ряде научных исследований показано, что определенная доля случаев идиопатического бесплодия сопряжена с наличием аномалий хромосом, которые вследствие неэффективной диагностики выявить зачастую не удается [8].

С помощью стандартных критериев ВОЗ, таких, например, как концентрация гамет, их подвижность и морфология, не всегда возможна точная оценка оплодотворяющей способности сперматозоидов. Даже несмотря на значительные отклонения от нормативов, фертильность может сохраняться, и наоборот, при нормозооспермии и исключенном женском факторе беременность не наступает [7].

Одной из причин нарушения репродуктивной функции является наследственная патология, связанная либо с аномалиями хромосом (как числовыми, так и структурными), либо с генными мутациями. При цитогенетическом обследовании лиц с мужским бесплодием 5–15 % из них имеют нарушения кариотипа (при анализе лимфоцитов периферической крови) [4]. В то же время в ряде случаев при нормальном кариотипе в соматических клетках могут определяться значительные нарушения числа и структуры хромосом половых клеток. Хромосомная патология часто сопровождается глубоким нарушением сперматогенеза, приводящим к бесплодию.

Особое внимание к вопросу генетических нарушений у бесплодных мужчин связано с тем, что широкое использование вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), в том числе ИКСИ, использование для оплодотворения незрелых половых клеток, позволило иметь потомство мужчинам с тяжелыми нарушениями генотипа. Изменения в генотипе родителей, приводящие к нарушению репродукции и невозможности зачатия ребенка естественным путем, при применении программы ВРТ могут передаваться будущему потомству [3].

Цитогенетическое исследование незрелых гамет на разных стадиях их развития у мужчин проблематично вследствие относительной трудности получения материала [2]. Появление молекулярно-цитогенетических методов открыло в изучении хромосом человека и их нарушений новое измерение — субмикроскопический уровень. Метод FISH-анализа (Fluorescence in situ hybridization) позволяет объективно выявлять индивидуальные хромосомы и их отдельные участки на метафазных пластинках (хромосомы в состоянии максимальной конденсации и визуализации) или интерфазных ядрах (деконденсированные хромосомы, без четкой морфологической структуры) на основе особенностей их молекулярно-генетического строения [6].

Для идентификации индивидуальных хромосом при проведении диагностики наиболее эффективны так называемые хромосомоспецифические ДНК-зонды, созданные на основе клонированных последовательностей сателлитной ДНК чело-века [2].

По мнению ряда авторов, у пациентов с низким качеством спермы увеличивается частота дисомии и диплоидии сперматозоидов [2, 3, 5–11, 13].

Цель исследования — изучение уровня анеуплоидий ядер сперматозоидов у пациентов с бесплодием.

Материал и методы

В период с 2011 по 2012 г. нами было обследовано 90 мужчин с диагнозом «бесплодие» (основная группа О) и 10 условно здоровых фертильных мужчин (конт-рольная группа К).

Всем пациентам проводилось стандартное обследование, включающее сбор анамнеза, анализ секрета предстательной железы, исследование на урогенитальные инфекции, определение уровня гонадотропных, половых гормонов, ультразвуковое исследование наружных половых органов и простаты, микроскопическое исследование эякулята с оценкой показателей согласно нормативам ВОЗ. Кроме того, пациентам проводилось FISH-исследование спермы с целью выявления количества анеуплоидий сперматозоидов.

Для определения уровня анеуплоидий сперматозоидов использовалась многоцветная проба AneuVysion для хромосом X, Y, 18 (Abbott-Vysis, USA) [12, 13]. Подготовку препаратов проводили непосредственно после сдачи пациентом эякулята. Необходимый объем спермы помещали в пробирку и трижды отмывали фосфатным буфером, после чего наносили на стекла и сушили 1 час при температуре +50 °С. Затем стекла опускали в емкость с фиксатором и оставляли на 18 часов при температуре –20 °С. Далее проводили деконденсацию путем инкубации в 0,1N растворе натрия гидроксида, ополаскивание стекол в фосфатном буфере, просушивание на воздухе, предгибридизационную подготовку препарата и нанесение пробы СЕР 18/X/Y на предварительно отмеченные зоны гибридизации. Стекло с нанесенными зондами помещали в гибридизатор с установленной программой денатурации и гибридизации при температуре +37 °С с длительностью от 4 до 12 часов. Затем для удаления негибридизовавшихся проб, а также с целью уменьшения кросс-гибридизации альфоидных последовательностей с центромерными участками других хромосом стекла подвергали отмывке. Препараты окрашивали и проводили детекцию флюоресцентных сигналов согласно стандартному протоколу [12]. Микроскопический анализ осуществляли с использованием флюоресцентного микроскопа, оборудованного соответствующим набором фильтров. Для исследования уровня анеуплоидий в сперматозоидах проводили анализ 1000 клеток [9, 13].

Полученные данные обрабатывали с помощью IBM PC с использованием электронной таблицы Excel.

Результаты и обсуждение

Возраст обследованных пациентов варьировал от 26 до 41 года и в среднем составил в группе О 32,07 ± 0,40 года, К — 32,70 ± 1,27 года (р > 0,05). Продолжительность периода бесплодия у пациентов группы О была от 1 до 9 лет, в среднем 3,06 ± 0,35 года. По данным спермограммы патозооспермия в группе О имела место у 90 % пациентов, астенозооспермия — у 83,33 %, олигозооспермия — у 13,33 %, тератозооспермия — в 76,67 % случаев (рис. 1).

По данным молекулярно-цитогенетического анализа методом FISH уровень анеуплоидий сперматозоидов в группе О варьировал от 0,12 до 8,40 %, тогда как в контроле — от 0,09 до 0,21 % (референсная норма — до 0,25 %) [11]. Количество пациентов с повышенным уровнем анеуплоидий сперматозоидов в группе О составило 75 (83,33 %). Средний уровень анеуплоидий в группе О составил 1,91 ± 0,40 % и превышал таковой в контроле (0,13 ± 0,02 %) в 14,69 раза (p < 0,0001) (рис. 2).

На рис. 3 представлен случай анеуплоидии у пациента Н., 28 лет, с наличием X-, Y- и 18-й хромосомы в ядре сперматозоида, на рис. 4 — случай анеуплоидии у пациента Р., 32 лет, с наличием X- и Y-хромосом и нулисомии по 18-й хромосоме по данным многоцветной пробы AneuVysion для хромосом X, Y, 18 (Abbott-Vysis, USA) (FISH-метод).

При этом у 6 (6,67 %) пациентов группы О был отмечен высокий уровень анеуплоидий (от 0,9 до 1,9 %) при нормальных показателях спермограммы.

Выявлена прямая корреляционная зависимость между уровнем анеуплоидии и наличием: астенозооспермии (r = 0,34, p < 0,0002), тератозооспермии (r = 0,37, p < 0,0001), патозооспермии (r = 0,25, p < 0,007). Не выявлено достоверных корреляционных связей между уровнем анеуплоидии и наличием олигозооспермии.

Наиболее часто встречающимися видами анеуплоидий являлись: наличие двух 18-х хромосом — 70 % случаев, удвоение Х-хромосомы в 8 % случаев, отсутствие одной из половых хромосом — в 4 %.

Выводы

Проведение молекулярно-цитогенетического анализа спермы методом FISH позволяет выявить высокий уровень анеуплоидий ядер сперматозоидов у пациентов с нарушением фертильности.

Наиболее часто встречающимися видами анеуплоидий являлись: наличие двух 18-х хромосом — 70 % случаев, удвоение Х-хромосомы в 8 % случаев, отсутствие одной из половых хромосом — в 4 %.

Выполнение FISH-исследования спермы показано всем пациентам с идиопатическим бесплодием.

Использование данного метода диагностики показано всем парам, планирующим лечение методом ЭКО/ИКСИ, с целью прогнозирования генетических нарушений эмбрионов и дает возможность генетической селекции у пациентов с высоким уровнем анеуплоидий ядер сперматозоидов.


Bibliography

1. Лабораторная диагностика мужского бесплодия / Долгов В.В., Луговская С.А., Фанченко Н.Д. [и др.]. — М.; Тверь: ООО «Издательство «Триада», 2006. — 145 с.

2. Никитин О.Д. Аномалии половых хромосом при мужской инфертильности / О.Д. Никитин, С.В. Базалицкая // Здоровье мужчины. — 2011. — № 4. — C. 151-155.

3. Особенности генотипа мужчин с нарушениями сперматогенеза / Ж.И. Глинкина, Л.Н. Кузьмичев, Л.Б. Киндарова [и др.] // Андрология и генитальная хирургия. — 2010. — № 2. — C. 38-43.

4. Савельева А.П. Структура хромосомной патологии среди пациентов с мужским бесплодием и патозооспермией: Дис... канд. биол. наук: 03.00.15, 03.00.25. — М., 2002. — 167 с.

5. Связь морфологических аномалий сперматозоидов с наличием хромосомных анеуплоидий в их ядрах / А.М. Феськов, И.А. Феськова, Е.С. Жилкова [и др.] // Здоровье мужчины. — 2009. — № 2. — C. 187.

6. Тавокина Л.В. Молекулярно-цитогенетическая диагностика в лечении пациентов с нарушением репродукции / Л.В. Тавокина // Медицинские аспекты здоровья женщины. — 2007. — № 3. — C. 20-24.

7. Трещенков Э.А. Исследование фрагментации ДНК сперматозоидов у мужчин в бесплодных браках / Э.А. Трещенков, С.Г. Жабин, И.И. Павленко // Мат-лы XX ежегодной междунар. конф. РАРЧ «Репродуктивные технологии сегодня и завтра». — 2010. — С. 64-65.

8. Diemer T. Developmental and genetic disorders in spermatogenesis / Diemer T., Desjardins C. // Hum. Reprod. Update. — 1999. — Vol. 5, № 2. — P. 120-140.

9. Frequency of aneuploidy in sperm from patients with extremely severe male factor infertility / Gianaroli L., Magli M.C., Cavallini G. [et al.] // Human. Reproduction. — 2005. — Vol. 20. — P. 2140-2152.

10. Shi Q. Aneuploidy in human spermatozoa: FISH analysis in men with constitutional chromosomal abnormalities, and in infertile men / Shi Q., Martin R.H. // Reproduction. — 2001. — Vol. 121. — P. 655-666.

11. Sperm aneuploidies and low progressive motility / G. Collodel, S. Capitani, B. Baccetti [et al.] // Human Reproduction. — 2007. — Vol. 22, № 7. — P. 1893-1898.

12. Sarrate Z. Fluorescence in situ hybridization (FISH) protocol in human sperm / Sarrate Z., Anton E. // J. Vis. Exp. — 2009. — Vol. 31, № 1. — Р. 1405-1412.

13. Ultrastructural sperm evaluation and 18, X and Y aneuploidies. Studies on varicocele III / Baccetti B., Bruni E., Capitani S. [et al.] // J. Androl. — 2006. — Vol. 27. — P. 94-101.


Back to issue