Журнал «Здоровье ребенка» 6 (49) 2013

Вступ

Helicobacter pylori (H.pylori) є визнаним збудником захворювань шлунка і викликає одну з найпоширеніших бактеріальних інфекцій людини у всьому світі. Хелікобактерна інфекція викликає імунні і запальні відповіді практично у всіх інфікованих осіб, але вираженість запалення залежить від взаємодії багатьох чинників, перш за все таких як вірулентність бактерій, генетичні детермінанти макроорганізму, особливості імунної відповіді, а також фактори навколишнього середовища [3, 7]. Крім бактеріальних факторів патогенності на прояви хелікобактерної інфекції також впливає імунна відповідь макроорганізму.

Характер перебігу запальної відповіді та специфічних імунологічних реакцій залежить від відмінності в генах, які контролюють захисні реакції організму, насамперед генів регуляторних молекул, що забезпечують перші етапи розвитку запальної реакції: розпізнавання патогену, активація внутрішньоклітинного шляху збудження і синтез медіаторів запалення.

Найбільш частою причиною відмінностей у структурі генів є точкові мутації — заміни одиничних нуклеотидів, або поліморфізм одиничних нуклеотидів (single-nucleotide polymorphism — SNP).

Дослідниками доведено, що саме SNP за рахунок формування специфічних алелей генів роблять важливий внесок у фенотипічні відмінності між людьми, у тому числі в індивідуальні особливості розвитку захисних реакцій, а також схильність до цілого ряду захворювань. Більшість виявлених SNP-замін частіше торкаються 5- або 3-кінцевих регуляторних ділянок генів, насамперед ділянки промотора, або розташовуються в некодуючих ділянках (інтрон) і не відображаються на амінокислотній послідовності трансльованого білка. Однак частина з них може впливати на швидкість транскрипції генів, стабільність мРНК і, тим самим, приводити до збільшення або зменшення кількості та рівня біологічної активності синтезованого пептиду [3, 6, 10, 11].

Особливий інтерес на сучасному етапі становлять дані щодо впливу поліморфізму генів, відповідальних за розпізнавання патогену і запуск сигнальних шляхів на початкових етапах запалення, на характер перебігу захисних реакцій дитини та схильність до ряду захворювань. Значною мірою ця варіабельність обумовлена поліморфізмом генів, що детермінують елементи вродженого й адаптивного імунітету, до яких відносяться компоненти сигнальної трансдукції [7, 13].

Сигнальні трансмембранні тол-подібні рецептори (Toll-like receptor — TLR) займають центральне місце в багаторівневій системі розпізнавання консервативних молекулярних структур мікроорганізмів, які були названі патоген-асоційованими молекулярними структурами (pathogen-associated molecular patterns — РАМР). Найбільш відомими РАМР грамнегативних бактерій є структурні компоненти зовнішньої мембрани — ліпополісахариди (LPS). Збудження TLR РАМР призводить до активації декількох груп генів, що беруть участь у регуляції запалення, механізмів захисту від інфекційних агентів. Особливу роль у розвитку інфекційно-запального процесу, викликаного H.pylori, відіграє образрозпізнаючий рецептор, такий як TLR4.

Продукція прозапальних цитокінів, хемокінів, активних радикалів кисню та азоту при хелікобактерній інфекції асоційована з дією ліпополісахаридів (LPS) H.pylori, які є потужними медіаторами запального процесу слизової оболонки шлунка і зумовлюють перебіг захворювання. Спочатку в екстрацелюлярному просторі LPS зв’язується з ліпополісахаридзв’язуючим білком (LBP), який функціонує як опсонін для солютабного CD14 (sCD14). Комплекс LPS-LBP транспортується до мембранозв’язаного CD14 (mCD14) для активації сигнального шляху. Оскільки mCD14 не має внутрішньоклітинного сигнального домену, то клітинна відповідь на LPS залежить від трансмембранного TLR4. LBP каталізує зв’язування LPS із протеїном MD-2. У подальшому каскаді молекулярних подій комплекс LPS/MD-2 взаємодіє з TLR4, викликаючи його димеризацію, збудження і запуск внутрішньоклітинних молекулярних шляхів, активацію таких факторів транскрипції, як ядерний фактор B (NF-B), активуючий протеїн 1 (AP-1), інтерферон-регулюючі фактори (IRF), транслокація яких у ядро клітини і взаємодія зі специфічними елементами ДНК обумовлює посилення активності експресії великої сукупності генів, що беруть участь в організації запальної відповіді, призводячи до продукції прозапальних цитокінів, хемокінів, активованих кисневмісних метаболітів та активних радикалів азоту, формуючи Th₁-відповідь. Збудження TLR4 призводить до цитодиференціювання ­Th₁-клітин, обумовлюючи розвиток макрофагально-нейтрофільного запалення [1, 2, 9].

Таким чином, інтегральними складовими вродженої імунної відповіді на інфекцію H.pylori є CD14, LBP, TLR4 і NF-B.

Активовані рецептори сімейства TLR запускають каскад адапторних і сигнальних молекул, що призводить до індукції вродженого й адаптивного імунітету. Активація TLRs призводить не тільки до індукції запальної реакції, але й до розвитку антиген-специфічного адаптивного імунітету. TLR регулюють активацію вродженого імунітету, забезпечують взаємозв’язок з адаптивним імунітетом через антиген-презентуючі клітини. Адекватна TLR-асоційована відповідь організму обумовлює ефективну ерадикацію Helicobacter pylori, запобігання розвитку хвороби, а в разі захворювання — видужання пацієнта. Однак дефіцитне збудження рецепторів при взаємодії з лігандами може стати основною причиною хронізації запалення, а надмірне — зумовити розвиток гострої системної запальної відповіді або виникнення автоімунного процесу [1, 8].

Аналіз структури гена TLR4 людини виявив 29 різних SNP, із яких більшість розташовані в позаклітинних доменах, що забезпечують розпізнавання LPS, однак тільки два з них пов’язані зі зміною функції відповіді на LPS, насамперед SNP Asp299Gly. Мутація AG в позиції +896 гена, який кодує TLR4, призводить до заміни аспарагіну на гліцин у положенні амінокислоти 299 (Asp299Gly), змінюючи структуру позаклітинного домену TLR4.

Мета дослідження — визначення особливостей хелікобактерної інфекції у дітей із поліморфізмом ASP299GLY гена TLR4.

Матеріал і методи

Під наглядом була 31 дитина (21 хлопчик та 10 дів­чаток) віком від 9 до 17 років із хронічною гастродуоденальною патологією (ХГДП), які проходили обстеження та лікування в умовах гастроентерологічного відділення Комунального закладу «Дніпропетровська міська дитяча клінічна лікарня № 1» Дніпропетровської ОДА. Пацієнти були розподілені на дві групи залежно від наявності гетерозиготного варіанта поліморфізму ASP299GLY гена TLR4 — генотипу (Asp/Gly) та «дикого», нормального генотипу (Asp/Asp) гена TLR4. Групу контролю становили 95 практично здорових осіб із бази генетичних зразків НДІ генетичних та імунологічних основ розвитку патології та фармакогенетики ВДНЗУ «УМСА».

На участь у науковому дослідженні, яке проводили з дозволу локальної комісії з біоетики ДЗ «ДМА МОЗ України», було отримано інформовану згоду батьків пацієнтів.

Методи дослідження: клініко-анамнестичні дані; загальні параклінічні методи дослідження; фіброезофагогастродуоденоскопія за загальноприйнятою методикою з узяттям біоптатів (2) слизової оболонки антрального відділу шлунка. Для ідентифікації Н.pylori-інфекції використовували: швидкий уреазний «Хелпіл»-тест та дихальний «Хелік»-тест (ТОВ «АМА», Росія, Санкт-Петербург); визначення в сироватці венозної крові сумарних імуноглобулінів (IgM, IgA, IgG) до Ag СаgА білка H.pylori методом імуноферментного аналізу («Вектор-Бест», Росія).

Визначення поліморфізму гена TLR4 Asp299Gly проводили методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) в НДІ генетичних та імунних основ розвитку патології та фармакогенетики ВДНЗУ «УМСА» (м. Полтава). Матеріалом для дослідження була периферійна венозна кров. Геномну ДНК виділяли за допомогою комплекту для виділення ДНК/РНК із сироватки або плазми крові («ЛитТех», Росія). Поліморфну ділянку Asp299Gly гена TLR4 ампліфікували за допомогою полімеразної ланцюгової реакції в 25 мкл реакційної суміши, що містила: 2,5 мкл 10 Buf для ампліфікації; 2 мМ хлориду магнію; 0,2 мМ кожного dNTP; по 66 нг праймерів для Asp299Gly: F: 5-GATTAGCATACTTAGACTACTACCTCCATG-3, R: 5-GATCAACTTCTGAAAAAGCATTCCCAC-3; 2,5 од. ДНК-полімерази Tag; 20–50 нг геномної ДНК.

У пробірки нашаровували 25 мкл мінерального масла. Ампліфікацію проводили на ампліфікаторі «Терцик» («ДНК-Технология», Москва). Для ідентифікації алелей проводили рестрикційний аналіз ампліконів за допомогою ендонуклеази рестрикції Bsp19 I («СибЭнзим», Росія). У результаті рестрикції були отримані фрагменти розміром 263 bp та 222 bp. Продукти розщеплення поліморфної ділянки гена виявляли за допомогою електрофорезу в 3% агарозному гелі в 1 ТВЕ (50 мМ трис-H₃BO₃ та 2 мМ ЕДТА, pH 8.0) (протягом 2 годин при напрузі 2 V на 1 см гелю). Як маркер молекулярної ваги ДНК використовували pBR322/Alu I. Гелі забарвлювали етидіумом бромідом із наступною візуалізацією результатів в УФ-освітленні.

Рівень експресії гена TLR4 визначали методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) у режимі реального часу в НДІ генетичних та імунних основ розвитку патології та фармакогенетики ВДНЗУ «УМСА». Виділення загальної РНК з клітин слизової оболонки шлунка (СОШ) проводили за допомогою комплекту реагентів «РИБО-золь-В» (AmpliSens, Росія). Для отримання кДНК в реакції оберненої транскрипції використовували праймер оліго(dT)₁₈. Аналізували експресію гена TLR4 методом ПЛР у реальному часі при наявності барвника SYBR Green I, шляхом відносного кількісного аналізу. Як референтний ген використовували ген b-актину. Для аналізу даних застосовували відносний Ср-метод із розрахунком за формулою Ср = Ср (TLR4) – Ср(b-актину).

Рівень NF-kB⁺ серед лімфоцитів (%) та максимальний рівень експресії NF-kB⁺ визначали з використанням відповідних моноклональних антитіл за допомогою проточної цитофлюорометрії в НДІ генетичних та імунологічних основ розвитку патології та фармакогенетики ВДНЗУ «УМСА».

Метод твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA) застосовували для оцінки концентрації в сироватці крові sCD14, використовуючи ELISA test kit (Diaclone, Франція) (лабораторія «Діагностичний центр медичної академії», м. Дніпропетровськ).

Статистичну обробку отриманих результатів проведено за допомогою пакетів комп’ютерних статистичних програм Statgraf, Matstat, Statistica 6.0. Вірогідність розбіжностей при розподілі, відмінному від нормального, оцінювалася за допомогою критерію Манна — Уїтні. Оцінку впливу частоти варіантів генотипів поліморфізму проводили за допомогою розрахунку епідеміологічних показників – відносного ризику (ВР) та відношення шансів (ВШ) із визначенням 95% довірчого інтервалу (ДІ). Статистично значущими вважали відмінності при р < 0,05;

Результати та обговорення

Проведені молекулярно-генетичні дослідження показали, що серед здорових осіб 96,85 % (92) мали нормальний варіант (Asp/Asp) гена TLR4, гетерозиготний варіант за алеллю Gly поліморфізму гена TLR4 (Asp299Gly) — генотип Asp/Gly виявлено у 2,1 % (2) осіб, в 1,05 % (1) — гомозиготний генотип Gly/Gly (рис. 1).

Серед дітей із хронічною гастродуоденальною патологією 83,87 % (26) мали «дикий» генотип Asp/Asp, що вірогідно не відрізняється від групи контролю (ВР = 0,86; ВШ = 0,11; P = 0,01). Гетерозиготний генотип Asp/Gly мали 16,13 % (5) дітей, що свідчить про високий ризик наявності такого варіанта несинонімічного нуклеотидного поліморфізму гена TLR4 в дітей, хворих на хронічні запальні гастродуоденальні захворювання (ВР = 7,92; ВШ = 8,85; Р = 0,01). Пацієнти з гомозиготним генотипом за алеллю Gly не виявлені. Можливо, це пов’язано з невеликою групою досліджених або свідчить про певне захисне значення наявності такого генотипу в геномі людини і може розглядатися як один із факторів стійкості до розвитку хронічного запалення шлунка. S.B. Moura і співавт. [13] також відмічали низьку частоту зустрічальності генотипу Gly/Gly у хворих на хронічні гастрити дітей (0,6–1,6 %), а в досліджених дітей із наявністю дуоденальної виразки даний варіант нуклеотидного поліморфізму гена TLR4 не виділявся в  жодного пацієнта.

Нами проведено аналіз розподілу варіантів SNP Asp299Gly гена TLR4 у дітей залежно від Н.pylori-статусу. Так, при порівнянні в дітей із позитивним Н.pylori-статусом питома вага гетерозиготного генотипу Asp/Gly була вищою, ніж у пацієнтів із Н.pylori-негативним статусом (17,4 та 12,5 % відповідно, ВР = 1,39; ВШ = 1,48; 95% ДІ 1,15–1,89; P = 0,75), що свідчить про тенденцію до зростання ризику інфікування Н.pylori в дітей, які мали мутантний генотип Asp/Gly (рис. 2).

«Дикий» генотип майже с однаковою частотою виявлявся в обох групах і не залежав від Н.pylori-статусу (82,6 та 87,5 % відповідно). Мутантний алель Gly також частіше реєструвався в групі дітей із позитивним Н.pylori-статусом, ніж із негативним (8,7 та 6,25 % відповідно).

Отримані результати вказують на важливу роль генотипу Asp/Gly в розвитку захворювань, викликаних грамнегативними бактеріями, зокрема Н.pylori, оскільки виявлена висока частота алелі G та генотипу Asp/Gly серед пацієнтів із хелікобактер-асоційованою хронічною гастродуоденальною патологією.

Найбільш вивченим фактором патогенності H.pylori є «острівець» патогенності генів (Сag-PAI), вбудований у геном найбільш вірулентних штамів H.pylori, та його маркер цитотоксин-асоційований ген A (cytotoxic-associated gene) — СagА. CagA є одним із найбільш відомих маркерів для cag PAI і предиктором патогенності H.pylori [12]. У зв’язку з чим нами проаналізовано наявність генотипу та алелей SNP поліморфізму (Asp299Gly) гена TLR4 в дітей, інфікованих СagA-позитивними та СagA-негативними штамами H.pylori.

Серед H.pylori-позитивних дітей СagA-позитивний штам був виявлений у 95,65 % дітей і лише в 4,35 % — СagA-негативний. Частота «дикого» генотипу Asp/Asp домінувала в обох групах дітей, інфікованих як СagA-позитивними, так і СagA-негативними штамами. Гетерозиготний SNP Asp299Gly гена TLR4 (генотип Asp/Gly) виявлявся частіше в дітей, інфікованих СagA-позитивними штамами Н.pylori (17,4 %), ніж у пацієнтів із СagA-негативним статусом (ВР = 1,07; Р = 0,87; ВШ = 0,73; 95% ДІ 0,05–21,06; Р = 0,85; p² = 0,70; Р = 0,40), але відмінності були статистично незначущими.

Проаналізовано особливості експресії образрозпізнаючого рецептора TLR4 у біоптаті слизової оболонки шлунка та ядерного фактора kB (NF-kB⁺) на лімфоцитах, рівня концентрації TLR4-аксесуарної молекули розчинного CD14 (sCD14) у сироватці крові залежно від SNP Asp299Gly гена TLR4.

Рівень експресії TLR4 у біоптаті СОШ дітей із гетерозиготним Asp/Gly варіантом SNP Asp299Gly був вірогідно нижчим, ніж із генотипом Asp/Asp, та становив відповідно 0,57 ± 0,06 і 1,10 ± 0,09 (P_u < 0,05).

Глікопротеїн СD14 — розчинна форма, локалізований у плазмі і забезпечує взаємодію LPS Н.pylori з немієлоїдними клітинами (зокрема, епітеліоцитами СОШ). При порівнянні показників рівня концентрації розчинного sCD14 відмічена їх вірогідна відмінність у групах залежно від варіанта SNP Asp299Gly гена TLR4. Так, у пацієнтів із генотипом Asp/Gly реєструвалися більш низькі рівні концентрації sCD14, ніж у дітей із «диким» генотипом Asp/Asp (2669,20 ± 506,66 нг/мл та 3239,46 ± 251,74 нг/мл; P_u < 0,05).

Максимальний рівень експресії ядерного фактора NF-kB⁺ на лімфоцитах був вищим у дітей із генотипом Asp/Gly, ніж із варіантом Asp/Asp, але отримані дані були вірогідно не значущими (відповідно 0,73 ± 0,08 та 0,67 ± 0,03; P_u > 0,05).

Узагальнюючи вищенаведені результати, необхідно зазначити, що в дітей із генотипом Asp/Gly SNP Asp299Gly гена TLR4 відзначалося зниження експресії TLR4 у біоптаті СОШ і рівня водорозчинного sCD14 при збереженні виражених запальних змін слизової оболонки. В умовах низької концентрації sCD14 LPS Н.pylori взаємодіє з mCD14, що в подальшому призводить до утворення комплексу LPS/TLR4/MD2 і збудження прозапальних внутрішньоклітинних шляхів, насамперед активації ядерного фактора NF-kB⁺. Наявність у дітей гетерозиготного варіанта SNP Asp299Gly гена TLR4 (генотип Asp/Gly), імовірно, обумовлює порушення експресії TLR4 у біоптаті СОШ, продукції водорозчинного sCD14 і сприяє інвазії Н.pylori. Також можна припустити, що запуск запального процесу здійснюється через активацію й інших внутрішньоклітинних молекулярних шляхів, можливо, NOD-асоційованих.

Висновки

1. Серед дітей із хронічними запальними гастродуоденальними захворюваннями вірогідно частіше, ніж у групі здорових осіб, зустрічається генотип Asp/Gly SNP Asp299Gly гена TLR4.

2. Наявність у дітей генотипу Asp/Gly SNP Asp299Gly гена TLR4 зумовлює схильність до інфікування Н.pylori.