Журнал «Здоровье ребенка» 7 (50) 2013

Введение

Роль апоптоза при вирусных инфекциях представляет фундаментальный интерес для понимания патогенетических процессов иммунной системы, имеет прикладное значение для объективного обоснования назначаемой терапии. В последние годы этот процесс представляет интерес c позиции молекулярной биологии, биохимии и генетики.

Апоптоз (от греч. apoptosis — листопад) представляет собой форму гибели клетки, которая выявляется с помощью морфологической идентификации: конденсации хроматина, уменьшения размера клетки, фрагментации ядра и цитоплазмы, образования апоптотических телец [1, 2]. Большинство вирусов, передающихся воздушно-капельным путем, в том числе Эпштейна — Барр вирус (ЭБВ), могут вызывать апоптоз в клетках дыхательного эпителия, при этом процесс апоптоза может активироваться через фактор некроза опухоли  (TNF) — апоптозиндуцирующий лиганд TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL), который приводит к селективному уничтожению инфицированных вирусом клеток [3–9]. TNF представляет собой растворимый цитокин, синтезируемый активированными Т-лимфоцитами и макрофагами в ответ на воспаление и инфекцию [10]. Связывание его с ­TNF-рецепторами (TNF-R) приводит к развитию той же реакции, что и при связывании Fas receptor (Fas-R) и Fas ligand (Fas-L or CD95 L), с той лишь разницей, что мобилизуется белок TRADD (TNF receptor-associated death domain) [11, 12]. Это, в свою очередь, приводит к усилению транскрипции фактора nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-kB) и активатора плазминогена-1 (АР-1) [13]. TNF стимулирует адгезию нейтрофилов на эндотелиальных клетках и их экстравазацию — миграцию к очагу воспаления из сосудистого русла (способствуя разрыхлению межклеточного матрикса), способствует активации нейтрофилов, усиливая фагоцитоз и продукцию супероксидных радикалов, а также экспрессию рецепторов комплемента на нейтрофилах, индуцирует экспрессию дополнительных Fas-рецепторов на Т-лимфоцитах, human leukocyte antigen (HLA-DR) и экспрессию высокоаффинного рецептора интерлейкина-2 (IL-2) [11, 13]. Т-клетки под действием TNF ускоряют пролиферацию в ответ на IL-2, а также увеличивают ­IL-2-зависимый синтез интерферона (IFN-). TNF является аутокринным и паракринным активатором макрофагов, усиливая их способность убивать микроорганизмы. TNF служит хемоаттрактантом для макрофагов и клеток Лангерганса в коже, стимулирует продукцию IL-1, простагландина Е₂ (PGE₂), гранулоцитарно-макрофагального колоние­стимулирующего фактора (ГМ-КСФ). TNF действует преимущественно на начальных этапах воспалительного процесса. Для его завершения необходим transforming growth factor beta (ТGF). Синтез TNF- снижается уже через несколько часов после активации. TNF оказывает сильное провоспалительное и катаболическое действие, обладает антимикробной и противоопухолевой активностью, взаимодействует с мембранным рецептором Fas-cемейства (р55) [3, 10–13].

В некоторых ситуациях апоптоз важен для жесткого регулирования в поддержании целостности тканей, функции и оборота клеток, поэтому, как правило, рассматривается как антивоспалительный процесс.

Роль апоптоза при вирусных инфекциях связана с ограничением масштабов инфекции, включая воспаление, и является общим клеточным ответом. Макрофагальные клетки, которые фагоцитировали апоптотические клетки, приобретают при этом противовоспалительные свойства. В таких макрофагах повышается экспрессия TGF и PGE₂, уменьшается продукция IL-8, TNF-, IL-1, monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1). Макрофаги, которые фагоцитировали апоптотические клетки, способны ингибировать пролиферацию Т-лимфоцитов в отличие от макрофагов, фагоцитирующих некротическую клетку [15].

В последнее время уделяется большое внимание изучению биологической активности белков, относящихся к семейству аннексинов. Аннексин V (Ann V) относится к семейству Cа⁺²- и фосфолипидсвязывающих белков, блокирующих фосфолипазу А. В механизме действия Ann V большое значение имеет его свойство связываться с отрицательно заряженными фосфолипидами, в том числе с фосфатидилсерином (ФС), экспозиция которого на клеточной мембране является одним из ранних признаков апоптоза [4]. Аннексин V, как и другие аннексины, не выделяется из нормальных клеток; источником внеклеточного Ann V являются апоптотические и разрушенные клетки [3, 16].

В исследованиях было показано, что B-cell lymphoma 2 (Bcl-2) напрямую или опосредованно препятствует высвобождению цитохрома С. Транслокация гена Bcl-2, приводящая к его гиперэкспрессии, характерна для В-клеточной лимфомы, некоторых форм рака и резистентности к химиотерапии [17–21]. Противовоспалительная и сохранная функция белка Вcl-2 заключается в защите эндотелиальных клеток путем ингибирования ядерного фактора NF-kВ и снижения выработки провоспалительных генов [15, 22].

Проапоптозный белок Bax (apoptosis regulator BAX or bcl-2-like protein 4), перемещаясь из цитоплазмы на поверхность митохондрий, инактивирует антиапоптозные белки, что приводит к образованию пор в митохондриях и выходу цитохрома С и других проапоптозных молекул из межмолекулярного пространства [23]. Проапоптозные члены Bcl-2 также увеличивают проницаемость митохондриальной мембраны, что ведет к попаданию проапоптозных белков в цитоплазму. Подобно другим членам семейства, Bax состоит из константных доменов Bcl-2 гомологов 1 (ВН 1) и 2 (ВН 2), что предопределяет их гомо- или гетеродимеризацию с Bcl-2. Несмотря на то, что Bax сам по себе не вызывает апоптоз, повышение уровня Bax ускоряет развитие апоптоза после сигналов смерти, таких как цитокиновая депривация или взаимодействие Fas с Fas-лигандом [23]. Возникновение апоптоза определяется соотношением гомодимеров Bax и Bax/Bcl-2 гетеродимеров. Когда Bcl-2 в избытке, апоптоз ингибируется. Однако если уровень Bax увеличивается в ответ на сигнал смерти, это способствует клеточной смерти.

Чувствительность лимфоцитов разных классов к апоптозу существенно отличается. Так, Т-клетки более чувствительны к апоптозу, чем В-лимфоциты [25]. Это объясняется тем, что активация рецептора антигенного распознавания Т-лимфоцита приводит к резкому повышению чувствительности клетки к апоптозу, в то же время активация антигенраспознающего рецептора В-клеток обусловливает резистентность этих лимфоцитов к апоптозу. Несмотря на то, что активированные В-лимфоциты способны выживать после взаимодействия со специфическим аутоантигеном, они не в состоянии развивать иммунный ответ без поддержки со стороны Т-хелперов.

Данные об образовании аннексина V, Fas/Apo1, Bax, Bcl-2, интрацеллюлярных INF и TNF при ЭБВ-инфекции малочисленны и противоречивы [26].

В связи с этим целью нашей работы стало изучение экспрессии в иммунокомпетентных клетках (ИКК) маркеров апоптоза Fas/Apo-1, Bcl-2, Bax, INF, TNF, аннексина V, количества ИКК, подвергшихся апоптозу в циркулирующей крови больных острой ЭБВ-инфекцией, для уточнения их роли в патогенезе заболевания.

Материалы и методы

Исследование проводилось среди 25 детей в возрасте от 3 до 18 лет, больных острой ЭБВ-инфекцией, которые находились на стационарном лечении в городской детской клинической инфекционной больнице города Киева с 2008 по 2012 год. Диагноз острой ЭБВ-инфекции устанавливали на основании данных анамнеза, клинического и лабораторного обследования (общий анализ крови, определение активности трансаминаз крови), выявления специфических маркеров ЭБВ-инфекции — антител классов IgМ VCA, IgG VCA, IgG EA к ЭБВ, отсутствия в крови IgG EBNA, определения ДНК ЭБВ в крови и слюне.

Мальчиков было 45 %, девочек — 55 %. Детей от 3 до 6 лет — 35 %, 7–9 лет — 25 %, 10–14 лет — 20 %, старше 14 лет — 20 %; со среднетяжелой формой заболевания — 50 % детей, легкой — 25 %, тяжелой — 25 %. Анализ жалоб и данных объективного обследования показал, что у всех детей заболевание начиналось остро, с интоксикационного синдрома, который проявлялся в виде общей слабости, вялости, недомогания (100 %), снижения аппетита (75 %), головной боли (83,3 %), тошноты (50 %), у детей с тяжелыми формами — артралгии, миалгии, рвоты. Со стороны центральной нервной системы также наблюдались изменения у всех детей в виде эмоциональной лабильности, плаксивости, повышенной возбудимости, отрицательной реакции на осмотр, вялости, нарушение сна выявлено у 66,7 % пациентов. Экзантема встречалась у 40 % больных — преимущественно у детей, принимавших в домашних условиях ампициллин или его производные. У большинства больных сыпь появлялась на 4–7-й день от начала лечения и сохранялась в течение 10–14 дней. Преобладала пятнисто-папулезная сыпь (61,9 %) средних и/или больших размеров, расположенная по всей поверхности тела, у большинства пациентов сыпь носила сливной характер. У 23,8 % детей сыпь была мелкоточечной, у 14,3 % — геморрагической. Гипертермический синдром регистрировался у всех детей. Повышение температуры тела до 38 °С — у 37,0 %; 38,1–39 °С — у 35,2 %; 39–41 °С — у 27,8 % пациентов. Поражение лимфоидной ткани обнаружено у всех больных. Системный характер лимфаденопатии — у 76,7 % детей. Преимущественно отмечалось увеличение подчелюстных (73,3 %), передне-, заднешейных (83,3 %), паховых групп (50 %) лимфатических узлов. Также были увеличены и другие группы лимфоузлов — подмышечные (50 %), затылочные (45 %), надключичные и подключичные (41,7 %). У всех больных наблюдалось поражение носоглотки: в виде заложенности носа — 86,8 % детей, отека лица и век — 52,8 %, затруднения носового дыхания — 75,5 %, храпа во время сна — 50 %. Выделения из носа появлялись после 4-го дня от начала болезни у 47,2 % пациентов. У всех детей имел место острый тонзиллит, который проявлялся дискомфортом, болью в горле при глотании, гиперемией слизистой оболочки ротоглотки, зернистостью мягкого неба, дужек, задней стенки глотки. На момент госпитализации наслоения на миндалинах наблюдались у 81,7 % больных. Из них у 65,3 % они были гнойные, у 34,7 % — пленчатые, у 25 % — творожистые. У 5 больных наслоений на миндалинах не было, у них отмечались лишь гиперемия и отечность слизистой оболочки ротоглотки. Постоянным симптомом заболевания была гепатомегалия, выявленная у всех детей. Явления гепатита с синдромом цитолиза наблюдали у каждого третьего больного. У этих пациентов при отсутствии гипербилирубинемии регистрировалось повышение активности аланинаминотрансферазы (70,5 ± 7,8 ед.), аспартатаминотрансферазы (59,0 ± 2,8 ед.). При этом желтушность кожи и слизистых оболочек имела место только у 24,5 % больных. У этих детей наблюдалась умеренная гипербилирубинемия (90,0 ± 4,6 мколь/л). Спленомегалия отмечалась у 86,7 % больных. Гематологические нарушения наблюдались у всех детей. В крови у 73,3 % пациентов отмечались умеренный лейкоцитоз (14,4 ± 3,5 • 10⁹/л), лимфоцитоз (88,3 %), моноцитоз (83,3 %). У 61,7 % больных были обнаружены атипичные мононуклеары (вироциты) (рис. 1), их количество в периферической крови колебалось от 10 до 55 %, СОЭ была повышенной у 70 % (25,0 ± 5,2 мм/ч).

Группу сравнения составили 25 практически здоровых детей — спортсменов в возрасте от 7 до 14 лет, которые были обследованы в соответствии с международным этическим протоколом.

Лимфоциты выделяли из стабилизированной этилендиаминтетрауксусной кислоты (50 ммоль/10 мл) венозной крови, разведенной 1 : 2 средой RPMI 1640 (Sigma, США) с добавлением 10% инактивированной фетальной телячьей сыворотки (GidcoBRL, Англия) в градиенте плотности фиколл-верографина (Pharmacia, плотность 1,077), трехкратно отмывали раствором PBS (pН 7,2; Flow Labs, Великобритания). Жизнеспособность клеток составляла 95–98 %. Фиксацию препаратов проводили на предметных стеклах в маркированных лунках (1 • 10⁶ клеток в 1 мл) в течение 3 минут в парах 10% нейтрального формалина. Перед окрашиванием мазки дважды промывали в PBS (pH 7,2). Маркеры апоптоза исследовали в сочетании с маркерами дифференцировки CD4, CD8, CD25, CD20. На фиксированные клетки наносили по 20 мкл моноклональных антител, меченных FITC или Су5, к CD4 или CD8,CD25, CD20 (НПЦ «МедБиоСпектр», Москва, ОНЦ РАМН) в оптимальной концентрации (0,5 мкг), инкубировали 15–30 мин при 4 °С в темноте, дважды промывали PBS. Маркеры апоптоза Bax, ­Bcl-2, iNOs, Fas/Apo, интрацеллюлярный INF и TNF, аннексин V выявляли с помощью моноклональных антител (Pharmingen, США), конъюгированных с флуоресцентными метками разного спектра свечения (FITC/519 — зеленый, PE/578 — желтый, Cy5/667 — красный, PerCP/678 — темно-красный). После окрашивания поверхностных антигенов препараты пермеабилизировали в 20 мкл раствора Cytofix/Cytoperm (BD™PhosFlow) в течение 10–20 мин при 4 °С, дважды промывали в растворе Perm/Wash (BD™PhosFlow). Затем окрашивали клетки АТ к рецепторам INF- и TNF, конъюгированным с FITC, в соответствии с индивидуальным для каждого маркера протоколом (BD Transduction Laboratories, Pharmingen™, США). Bax исследовали непрямым иммунофлюоресцентным методом с применением очищенных мышиных моноклональных антител против человеческого Bax (Pharmingen™, США) в конечной концентрации 5 мкг/мл на 106 ИКК. Связавшиеся первичные антитела визуализировали с помощью вторичных АТ, меченных PerCP(exc488/532, em-max 678). Вторичные АТ — кроличьи антимышиные IgG1, конъюгированные с PerCP (Pharmingen™, США), — светятся в красной части спектра. Bcl-2 выявляли после фиксации раствором 1% сапонина в PBS и пермеабилизации в 20 мкл Сytofix/Cytoperm (BD™PhosFlow) 10 мин при 4 °С, дважды промывали PBS и окрашивали моноклональными антителами, меченными PE (Pharmingen, США), 30 минут при 4 °С в темноте. Свечение учитывали в желтом спектре (Lazer 514 nm, фильтр BP 560–615). ІNOs определяли с помощью моноклональных антител, конъюгированных с FITC, в соответствии с протоколом BD Transduction Laboratories (Pharmingen™, США). Окрашивали препараты с помощью набора Pharmingen™ (США) для выявления аннексина V/пропидия йодида в соответствии с протоколом фирмы Pharmingen. Ядра лимфоцитов окрашивали Hoetch (Sigma) в синий цвет. Результаты учитывали на двух конфокальных лазерных сканирующих микроскопах: Axioskop-2 LSM 5 PASCAL и Axiocam HRO LSM PASCAL 510 META (Carl ZEISS) с гелий-неоновым и аргоновым лазерами (Lazer 488 nm, фильтр BP 505–530; Lazer 514 nm, фильтр BP 560–615, Lazer 543 nm, фильтр LP650). Объектив — 100/1,4 160/017, окуляр 10(23), масляная иммерсия. Полученные изображения сканировали и обрабатывали с помощью компьютерной программы LSV510.

Статистическую обработку результатов исследования проводили с помощью MS Excel 2007. Определялись средние показатели (t-тест Student) и стандартные отклонения (М ± SD). Разницу частот определяли по методу оценки разницы между частотами появления признака в отдельных сериях наблюдения, статистически достоверной считали разницу, если р < 0,05 [27].

Результаты исследования

Cравнительное исследование маркеров апоптоза при острой ЭБВ-инфекции показало высокую степень их экспрессии (рис. 1). Все изучаемые маркеры апоптоза: Fas/Apo-1, Bax, INF, TNF, аннексина V, ­Bcl-2 — превышали контрольные значения в 2–3 и более раза (р < 0,05) (рис. 2).

У детей с острой ЭБВ-инфекцией при госпитализации в стационар уровень Fas/Apo-1 превышал контрольное значение в 2,9 раза, Bcl-2 — в 2,3 раза, Bax — в 3,2 раза, INF — в 3,1 раза, TNF — в 3 раза, аннексина V — в 2,5 раза (p < 0,05) (табл. 1).

На рис. 3 для примера представлена экспрессия Bcl-2 и Bax в CD4-, CD20-, CD25-лимфоцитах при острой ЭБВ-инфекции.

Обсуждение результатов

Роль изучаемых маркеров апоптоза на течение ЭБВ-инфекции у детей, с одной стороны, указывает на компенсаторные возможности иммунной системы за счет усиления экспрессии гена Bcl-2 и усиления экспрессии гена Вах в субпопуляциях CD4 и CD8. Активация экспрессии проапоптозного рецептора к TNF в основном пуле клеток приводит к индукции экспрессии дополнительных Fas-рецепторов. Высокая экспрессия Fas-R на ИКК у больных ИМ ЭБВ-этиологии детей c одновременной активацией экспрессии дифференцировочного маркера СD8 (потенциально несущие Fas-L) свидетельствует о направлении апоптоза по оксидазотному и Fas-опосредованному пути. Основную роль в элиминации инфицированных клеток у больных ЭБВ-инфекцией детей выполняют цитотоксические Т-супрессоры. Активизация экспрессии маркеров апоптоза способствует высвобождению большого количества оксида азота, который индуцирует выделение токсических для патогенов субстанций, способствуя усилению апоптотической гибели внутриклеточно персистировавших патогенов. Низкое количество апоптозных клеток в популяции Т-хелперов зависит от высокой экспрессии в них антиапоптозного гена Bcl-2, который защищает клетки от апоптоза. Еще одним аргументом в пользу компенсаторных реакций иммунной системы при ИМ у детей можно отнести нормальный уровень экспрессии внутриклеточного INF, представляющего собой резерв макрофагальной и цитотоксической активности в антивирусной и антипролиферативной защите.

В доступной нам литературе встречаются единичные работы по изучению апоптоза при ЭБВ-инфекции. Так, Г.Ф. Железникова и соавт. провели изучение апоптоза при инфекционном мононуклеозе ЭБВ-этиологии у детей и получили данные, свидетельствующие о том, что нарастающая выраженность клинических симптомов острого инфекционного мононуклеоза у детей ассоциирована с изменением ведущего профиля механизмов иммунной защиты, снижением экспрессии Fas/CD95 и склонности к спонтанному апоптозу in vitro. Высокий ответ Т-лимфоцитов в ФГА-РБТЛ, повышенный уровень TNF, относительно низкий уровень синтеза IgA и IgE, накопления ЦИК у детей с относительно легким течением инфекционного мононуклеоза косвенно свидетельствуют о преимущественно клеточно-опосредованной направленности иммунного ответа. Напротив, супрессия ФГА-РБТЛ, преобладание IL-4 при сниженной концентрации TNF в крови, повышенное содержание в крови CD21⁺ В-лимфоцитов и плазматических клеток, активация синтеза IgA и особенно IgE, усиленное накопление ЦИК у детей с клинически более выраженным инфекционным мононуклеозом позволяют предположить у них смещение баланса Th1/Th2 в сторону превалирования Th2 и гуморальной формы иммунного ответа. Это сопровождается снижением экспрессии рецептора апоптоза CD95 на циркулирующих лимфоцитах и повышением выживаемости клеток в культуре [26].

Патогенетическая значимость модуляции иммуногенеза и апоптоза при острой Эпштейна — Барр вирусной инфекции остается неясной, что диктует необходимость дальнейших исследований. Не исключено, что при данной инфекции снижение экспрессии CD95 и готовности лимфоцитов к спонтанному апоптозу in vitro является неблагоприятным признаком, так как оно ассоциировано с переключением на менее эффективный при вирусной инфекции гуморальный путь иммунной защиты с присущими такому переключению проявлениями иммуносупрессии, прежде всего в виде подавления пролиферативного ответа Т-лимфоцитов на ФГА [26].

Таким образом, данная работа по изучению состояния апоптоза иммунокомпетентных клеток при острой ЭБВ-инфекции является актуальной и требует дальнейшего исследования.

Выводы

1. У детей с острой Эпштейна — Барр вирусной инфекцией имеет место нарушение экспрессии маркеров апоптоза иммунокомпетентных клеток.

2. У детей уровень Fas/Apo-1 превышал контрольное значение в 2,9 раза, Bcl-2 — в 2,3 раза, Bax — в 3,2 раза, INF — в 3,1 раза, TNF — в 3 раза, аннексина V — в 2,5 раза по сравнению с показателями в группе сравнения.