Журнал «Здоровье ребенка» 8 (51) 2013

Введение

Рекогниция внеядерно расположенных нуклеиновых кислот — один из древнейших механизмов защиты от внутриклеточных инфекционных агентов, который индуцирует преимущественно продукцию IFN I типа, обусловливая развитие многовекторного ответа, ингибирующего репликацию вирусов, ограничивающего диссеминацию инфекционных агентов, индуцирующего лимфоцитарные эффекторные системы [20, 21]. До недавнего времени единственным известным сенсором внеядерно расположенных молекул ДНК являлся TLR9, который участвует в процессах рекогниции естественной В-формы двуцепочечной ДНК (дцДНК) вирусов, бактерий, апоптотических клеток, синтетических В-форм ДНК, предопределяя ответную продукцию IFN I типа макроорганизмом [8]. Однако было установлено, что ответная продукция интерферона на внутриклеточное введение ДНК стимулируется в TLR- и Myd88-дефицитных клетках, что позволило сделать предположение о существовании специфических цитоплазматических рецепторов, распознающих ДНК [23, 24].

Основными цитоплазматическими сенсорами ДНК считают DAI/ZBP1 семейства Z-ДНК-связывающих белков и AIM2 семейства HIN-200 белков (табл. 1).

В настоящее время появились доказательства того, что в распознавании цитоплазматически расположенной ДНК принимают участие и такие протеины, как ДНК-зависимая РНК-полимераза III, LRRFIP1 (leucine rich repeat (in FLII) interacting protein 1), Ku70 (ATP-dependent DNA helicase 2 subunit KU70), DHX9 (DEAH (Asp-Glu-Ala-His) box helicase 9), DHX36 (DEAH (Asp-Glu-Ala-His) box polypeptide 36), DDX41 (DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 41), cGAS (cGAMP синтетаза — человеческий гомолог E330016A19) (рис. 1) [1, 26].

Семейство Z-ДНК-связывающих протеинов

В 2007 году ранее известный протеин DLM-1-Z-DNA/ZBP-1 был идентифицирован Akinori Takaoka и cоавт. [2] как цитоплазматический рецептор ДНК, участвующий в рекогниции цитозольно локализованной Z-ДНК и в регулировании продукции IFN I типа, в связи с чем он получил новое название — ДНК-зависимый активатор интерферон-регулирующих факторов (DNA-dependent activator of IFN-regulatory factors DAI).

Семейство Z-ДНК-связывающих протеинов образовано четырьмя Z-ДНК-связывающими протеинами (ADAR1, DAI, PKZ и протеином E3L покс­вируса). Три представителя данного семейства (ADAR1, DAI, PKZ) являются непосредственными компонентами системы неспецифической защиты организма. Протеин DAI идентифицируется только у человека, ADAR1 — практически у всех многоклеточных животных и является ингибитором DAI-ассоциированного возбуждения, PKZ — у таких рыб, как рыба-зебра (Danio Renio), серебряный карась (Salmo Salar) [2, 29, 33].

Молекулярная структура протеина DAI

Молекула протеина DAI состоит из двух Z-ДНК-связывающих доменов (Z и Z) (ZBD), домена D3, который является доменом предполагаемого связывания B-формы ДНК, и C-терминального региона, который содержит TID — TBK1-IRF-взаимодействующий домен (рис. 2).

Z домен молекул DAI или ADAR1, представляющий особую подгруппу семейства HTH (helix-turn-helix) доменов, участвующих в рекогниции В-форм ДНК, является субстратом, который непосредственно взаимодействует с Z-формой ДНК. Активация Z-ДНК-связывающих доменов обусловливает индукцию димеризации молекул DAI, в которой определяющую роль играет домен Z [22].

В трех доменах DAI располагаются аминокислотные последовательности, которые напоминают гомотипические RIP-взаимодействующие мотивы (RHIM) [3, 11]. RHIM-подобные мотивы, получившие названия RLR-A, RLR-B и RLR-C, обусловливают взаимодействие DAI с адаптерной молекулой RIP1 [31].

Локализация и экспрессия протеина DAI

DAI высокоэкспрессирован не только в клетках стромальной опухоли, где он впервые был определен, но и в лимфоцитах, макрофагах и других клетках различных тканей и органов. Максимальная экспрессия мPHR DAI отмечается в селезенке, легких, почках и тонком кишечнике (рис. 3).

Экспрессия DAI индуцируется B-ДНК, IFN-стимулирующей ДНК, LPS, IFN, IFN [13].

Протеин DAI локализуется в цитоплазме клеток около эндоплазматического ретикулума в виде диффузно распределенных гранулоподобных образований, ассоциированных со стресс-гранулами и не связанных с какими-либо клеточными органеллами [4, 19]. Гранулы, содержащие DAI, отличаются от процессинговых гранул и стресс-гранул [4].

Лиганды протеина DAI

В отличие от TLR9, который участвует в рекогниции исключительно B-дцДНК, лигандами DAI являются экзогенные или эндогенные B- и Z-формы дцДНК [18]. Молекула ДНК в зависимости от условий может существовать в разных конформационных формах — A-, B-, C-, Z- и других (табл. 2, рис. 4), которые образуют большие полиморфные семейства ДНК. Основная часть ДНК в клетках пребывает в В-форме, которая представляет стандартную уотсон-криковскую молекулярную структуру [12, 28].

Молекула ДНК Z-семейства (Z-, Zi-, Zii- и Z'-ДНК), открытого в 1979 году при исследовании структуры гексануклеотида d(CG), характеризуется левоспиральной конформацией с длиной витка 4,4 нм, на который приходится 12 нуклеотидных пар, и зигзагообразной формой сахарофосфатного остова. Z-форма в отличие от B-формы ДНК высокоиммуногенна. Данная форма присуща богатым на CpG-повторы участкам молекулы дцДНК [2, 7, 17].

Проведенное сравнительное исследование зависимости активации DAI от конформационной формы ДНК показало, что B-форма дцДНК является более мощным стимулятором продукции ­IFN, чем Z-ДНК, но продукция хемокинов Cxcl10 и Ccl5 не зависит от формы ДНК. По мнению авторов, рекогниция DAI разных конформационных типов ДНК выполняется различными молекулярными механизмами, что приводит к определенному распределению силы возбуждения между NF-kB- и IRF-связанными сигнальными путями [3, 8].

Daniel B. Stetson, Ruslan Medzhitov [20] показали, что существует внутриклеточное распознавание ДНК, которое приводит к активации IRF, не возбуждая МАРК и IKK.

Распознавание ДНК протеином DAI

При взаимодействии с ДНК происходит связывание значительного числа молекул DAI с одним отрезком ДНК и мультимеризация DAI. Согласно мнению Zhi Chao Wang и соавт. [18], начальное взаимодействие домена D3 молекулы DAI с дцДНК приводит к конформационному изменению молекулы DAI таким образом, что Z- и Z-связывающие ДНК домены становятся доступными для взаимодействия с молекулой ДНК. Участие в рекогниции трех доменов DAI формирует устойчивый комплекс DAI/ДНК. В последующем мультимеры DAI рекрутируют TBK1 и IRF3. Считается, что DAI является основным сенсором, возбуждение которого обеспечивает продукцию IFN при инфекциях, вызванных герпесвирусом 1-го типа и цитомегаловирусом [3, 9]. DAI-опосредованную продукцию IFN I типа вызывают и бактериальные инфекционные агенты — L.pneumophila [20], Listeria monocytogenes [10], Shigella flexneri, enterophathogenic E.coli [23].

Внутриклеточные сигнальные пути, ассоциированные с протеином DAI

Организация мультимеров DAI является важнейшим компонентом DAI-ассоциированного возбуждения. Экспериментально показано, что формирование димера DAI в условиях отсутствия ДНК приводит к продукции IFN I типа [18]. Активированная DAI формирует тандемный массив вдоль ДНК, c которым лиганд-зависимым способом взаимодействуют: 1) TBK1, индуцирующая фактор транскрипции IRF-3, ведущий к продукции IFN; 2) адаптерная молекула RIP-1, индуцирующая фактор транскрипции NF-kB, возбуждающий продукцию провоспалительных цитокинов (рис. 5) [3, 23].

Существуют данные, которые позволяют предполагать, что в дцДНК-индуцированном возбуждении принимают участие митохондриальные протеины и протеины эндоплазматического ретикулума — ­IPS-1 и STING/MITA [31].

Регуляция активности DAI-ассоциированного возбуждения

В настоящее время идентифицировано два основных протеина, которые участвуют в ингибировании DAI-индуцированного возбуждения: ADAR1; 3'-5'-репарирующая эндонуклеаза 1 (TREX1) [33].

ADAR1 является IFN-индуцибeльным белком, который обладает ДНК-связывающими доменами. У млекопитающих идентифицированы четыре представителя протеинового семейства ADAR — ADAR1, ADAR2, ADAR3, TENR, из которых IFN-индуцибельный синтез характерен для ADAR1. Фермент ADAR1 представлен тремя изоформами — длинной р150 (первичным продуктом трансляции) и двумя его производными — функционально активными короткими изоформами р80, р110. Длинная р150 изоформа ADAR1 состоит из 1226 аминокислотных остатков и характеризуется наличием в N-терминальном регионе нетипичной последовательности ядерного импорта NLS, двух ZBD, трех дц-РНК-связывающих доменов (DRBM) и в С-конце — каталитического домена дезаминазы. Короткая изоформа р80 состоит из 502 аминокислотных остатков дезаминазного региона. Ген, кодирующий ADAR1, расположен на длинном плече хромосомы 1 (1q21.1-21.2). Синтез ADAR1 индуцируется IFN и IFN и дцРНК. Продукция ADAR1 осуществляется преимущественно альвеолярными макрофагами. Ядерный экспорт ADAR1p150 в цитоплазму осуществляется при участии рецептора CMR1, который формирует экспортный комплекс с RanGTP. Особенности строения молекулы длинной формы ADAR1 предопределяют ее локализацию в цитоплазме клетки. Короткая изоформа р80 представляет собой курсирующий из ядра в цитоплазму и обратно белок, блокирование ядерного экспорта которого обусловливает его внутриядерную аккумуляцию [2, 32]. В начале острых инфекционных заболеваний экспрессируется длинная форма ADAR1, которая обладает самым высоким аффинитетом к молекуле РНК [32]. По мере развития инфекционного процесса происходит переключение синтеза длинной формы на синтез короткой р80 изоформы ADAR1, которая накапливается в ядре клетки. Каталитическая активация ADAR1 связана с димеризацией молекулы. Протеин ADAR1, дезаминируя аденозин, осуществляет посттранскрипционную модификацию вирусной РНК по типу A to I (аденозин в иозин), нарушая функционирование вирусных РНК [5, 16, 30]. Также ADAR1 взаимодействует с ядерным фактором NF90, вызывая NF90-опосредованную экспрессию генов [15]. ADAR1, конкурируя с DAI за связь с дцДНК, способствует снижению уровня DAI-ассоциированного возбуждения [18, 31].

Протеин TREX1 относится к группе белков, индуцирующих и связывающих интерферон-стимулирующую ДНК. TREX1 (прежнее название протеина — дезоксирибонуклеаза III) — один из наиболее экспрессируемых клетками организма человека представителей семейства автономных 3'-5'-экзонуклеаз ДНК. Автономные экзонуклеазы, находясь в ядре клетки, осуществляют репарирующую функцию, а при переходе в цитоплазму они разрушают аберрантную ДНК, возникшую при репликации, предупреждая развитие аутоиммунных заболеваний. Показано, что протеин TREX1 является ключевым компонентом регуляции уровня продукции IFN I типа, благодаря которому, по мнению Hideyuki Yanai и соавт. [31], ингибируется избыточный синтез IFN, тем самым предотвращая развитие аутоиммунного процесса при ДНК-индуцированном воспалении. Ген TREX1, расположенный на хромосоме 3 (3p21-14), состоит из единственного экзона и кодирует белок из 314 аминокислотных остатков. Характерной особенностью молекул данного семейства экзонуклеаз является наличие в N-терминальном регионе трех консервативных последовательностей: Exo I, Exo II и Exo III, которые формируют энзиматический сайт, обладающий активностью по отношению к дцДНК и оцДНК (рис. 6) [25].

Способность протеина TREX1 связываться с ДНК обусловливает его ингибирующее действие на DAI-ассоциированное возбуждение. В дополнение к трем экзонуклеазным мотивам протеин TREX1 содержит обогащенную пролиновыми остатками последовательность (спираль PPII) и состоящий из 72 аминокислотных остатков высокогидрофобный С-терминальный домен, который формирует трансмембранную спираль и обеспечивает локализацию протеина TREX1 на эндоплазматическом ретикулуме. Спираль PPII участвует в белково-белковых взаимодействиях с Src гомолог 3, WW и EVH1 доменами [14]. Активация смертельного внутриклеточного пути и действие ДНК-разрушающих веществ обусловливают транслокацию протеина TREX1 в ядро клетки, где он взаимодействует с 3-концом ДНК [25].

У Trex1-нокаутных мышей развивается летальный аутоиммунноподобный воспалительный миокардит, который сопровождается гиперпродукцией IFN I типа [6].