Журнал «Актуальная инфектология» 1 (2) 2014

Статья опубликована на с. 6-10

Поява нових класів препаратів прямої противірусної дії суттєво збільшує шанси на досягнення успіху в терапії хронічного гепатиту С (ХГС). Загальновизнаним критерієм повного виліковування ХГС є стійка вірусологічна відповідь (SVR), що визначається як авіремія протягом 24 тижнів після завершення курсу противірусної терапії (ПВТ). Однак не менш важливим показником одужання, що корелює з рівнем виживання хворих, є зниження некротично–запальної активності та стадії фіброзу печінки. Водночас широко відомі факти, коли, незважаючи на досягнення SVR, гістологічна картина ХГС не демонструє покращення, а деколи, навпаки, набуває ознак циротичної трансформації і гепатоцелюлярної неоплазії [1]. Тому вивченню закономірностей фіброгенезу при ХГС сьогодні присвячується багато досліджень [2, 3]. Зокрема, виявлено пряму кореляцію між Т–алелем гена IL28b та швидкістю прогресування ХГС до цирозу печінки (ЦП) і гепатоцелюлярної карциноми (ГЦК) [4]. Однак залишаються нез’ясованими закономірності інтерферон–опосередкованої регресії фіброзу та його прогресування після завершення ПВТ. Метою нашої роботи стало дослідження зв’язку між ступенем зниження HCV-–індукованого фіброзу печінки на момент закінчення ПВТ ХГС та основними варіантами поліморфізму гена IL28b.

Матеріали та методи

Під час дослідження нами було ретроспективно проаналізовано результати лікування 324 хворих, які отримували стандартну противірусну терапію з приводу ХГС 1b генотипу у Львівській, Полтавській, Харківській обласних інфекційних клінічних лікарнях (167 осіб) та в гепатологічному відділенні лікарні Pitié-–Salpêtrière, м. Париж (157 осіб). Стандартом лікування ХГС 1b генотипу вважали комбінацію пегільованих інтерферонів PegIFN-–alpha2b (1,5 мкг/кг) або PegIFN-–alpha2а (180 мкг) і рибавірину (10 мг/кг) із загальною тривалістю 12 місяців. Із дослідження вилучалися пацієнти, які були коінфіковані HBV чи мали іншу патологію печінки (алкогольну хворобу печінки, неалкогольний стеатогепатит, автоімунний гепатит, гемохроматоз), а також хворі, яким проводилася монотерапія PegIFN, комбінацією лінійних IFN та рибавірину, та ті, які переліковувалися повторно. У групах порівняння оцінювали три варіанти вірусологічної відповіді: швидку (RVR, 4–-й тиждень ПВТ), ранню (EVR, 12–-й тиждень ПВТ) та стійку (SVR, 24–-й тиждень після завершення ПВТ). Вікова, гендерна та клінічна характеристика хворих наведена в табл. 1.

Вірусне навантаження гепатиту С визначали при використанні проби кількісного аналізу Abbott M2000sp/rtHCV у реальному часі (Abbott, Ранжі, Франція). Генотипи вірусу гепатиту С визначали під час часткового секвентування гена NS5B та порівняння отриманої послідовності нуклеотидів з еталонним штамом шляхом філогенетичного аналізу.

Стадію фіброзу оцінювали за шкалою METAVIR методом FibroTest, що обраховували за значеннями віку, статі та п’яти біохімічних показників: альфа–-2-–макроглобулін, гаптоглобін, гамма-–глутамілтранспептидаза (GGT), загальний білірубін та аполіпопротеїн A1 [5, 6]. Співвідношення шкал FibroTest та METAVIR з описом відповідних гістологічних змін наведено в табл. 2.

Аполіпопротеїн A1, альфа-–2-–макроглобулін та гаптоглобін визначали методом турбідиметрії (системами Modular та Cobas Integra від Roche Diagnostics, Мангейм, Німеччина) та нефелометрії (BNII від Dade–Behring–Siemens Healthcare Diagnostics, Дірфілд, Іллінойс, США), а також при використанні реагентів виробника (Roche Diagnostics, Мангейм, Німеччина, Siemens Healthcare Diagnostics, Дірфілд, Іллінойс, США) і реагентів Diagam (Гіленґ’єн, Бельгія) для турбідиметричного аналізу на альфа-–2–-макроглобулін. Коефіцієнт варіації всіх тестів був нижчим за 3 %. GGT, аланінамінотрансфераза (АЛТ), аспартатамінотрансфераза (АСТ), загальний білірубін, загальний холестерин, тригліцериди та глюкоза натще визначалися з використанням аналізаторів Hitachi 917, Modular та Cobas Integra (Roche Diagnostics, Мангейм, Німеччина). ActiTest враховував вищезазначені перераховані маркери та АЛТ. У 65 хворих стадію фіброзу було оцінено у кратних обстеженнях: до та після курсу ПВТ.

В усіх 324 пацієнтів визначали варіант поліморфізму гена IL28B за встановленим однонуклеотидним поліморфізмом рестрикційного фрагменту rs12979860 19-–ї хромосоми, вивчаючи вільноциркулюючу ДНК сироватки крові після екстракції автоматизованою системою NucliSENS^®easyMag^®. Генотип IL28b визначали аналізом кривої плавлення гібридизаційних зондів із використанням інструменту LightCycler^®480 (Roche Diagnostics, Мелан, Франція). Генотипи Il28b було визначено, як CC, CT або TT. Генотипування поліморфної ділянки проводилося із використанням системи ABI TaqMan allelic discrimination kit та the ABI7900HT Sequence Detection System (виробництва Biosystems, Carlsbad, CA, США).

У статистичному аналізі використовували: точний критерій Фішера, критерій хі-–квадрат, критерій Стьюдента, критерій Манна — Уїтні та складну логістичну регресію для багатоваріаційного аналізу. Для всіх аналізів використовували двосторонні статистичні випробовування; показник p, що дорівнював 0,05 чи менше, вважався значущим. В оцінці всіх вірогідностей використовували програмне забезпечення Number Cruncher Statistical Systems 2003 (NCSS, Кайсвіль, Юта, США).

Результати та обговорення

Усі варіанти виявлених нами змін стадій фіброзу на момент закінчення ПВТ порівняно з вихідними значеннями розподілилися на такі групи: 1 — суттєве зниження фіброзу (понад 0,35 пункту за шкалою FibroTest або на два ступені за шкалою METAVIR, табл. 2) констатовано у 25 % пролікованих пацієнтів, 2 — помірне зниження фіброзу (в середньому на 0,17 пункту за шкалою FibroTest або на один ступінь за шкалою METAVIR) — у 64 % хворих, 3 — незмінний ступінь фіброзу — 7,6 %, зростання фіброзу (в середньому на 0,24 пункту за шкалою FibroTest або до 1-–го ступеня за шкалою METAVIR) — 3,4 % (рис. 1).

При порівняльному аналізі таких традиційно визначальних предикторів SVR, як вірусне навантаження, генотип HCV, ступінь фіброзу, вік та стать, було встановлено, що жодна досліджувана група не мала переваг щодо шансів на досягнення SVR. Вірогідні відмінності стосувалися лише суттєвого переважання хворих із надмірною масою тіла серед пацієнтів вітчизняних клінік (76 проти 34 %, p < 0,0001; негативний предиктор SVR) та значного числа осіб негроїдної раси серед пацієнтів клініки Pitié–-Salpêtrière (18 проти 0 %, p < 0,0001; негативний предиктор SVR) (табл. 3).

Незважаючи на те, що для осіб негроїдної раси, як відомо, характерним є переважання Т–-алеля гена IL28b, за даними проведених молекулярно-–генетичних досліджень, відмінності в частоті варіантів поліморфізму IL28b серед хворих українських та французьких клінічних центрів були статистично невірогідними (табл. 4).

Загальне співвідношення основних варіантів поліморфізму гена IL28b серед 324 обстежених хворих становило: СС — 34 %, CT — 50 %, TT — 16 %. Незважаючи на тотожність рандомізованих груп за предикторами SVR, аналіз ефективності ПВТ у цих групах показав статистично вірогідну відмінність: частота SVR серед українських пацієнтів — 63 проти 47 % — серед пацієнтів клініки Pitié–-Salpêtrière (р < 0,05). На перший погляд, таку високу ефективність ПВТ в українських клініках можна було б пояснити молодшим віком пацієнтів або гіршим комплайєнсом французьких хворих, однак істинні причини відмінностей у частоті SVR у цих групах вдалося з’ясувати лише завдяки побудові п’яти 2–-факторних моделей із фактором популяції та з кожним з п’яти прогностичних факторів: генотип IL28b, стадія фіброзу, ступінь запалення, генотип вірусу та вірусне навантаження. Значення співвідношення шансів (odds ratio, OR) з однією змінною групи перевірки вірогідності становило 1,98 (1,14–3,45; P = 0,02). При цьому прогностичне значення генотипу IL28b в українській групі виявилося вірогідно вищим — 8,95 (діапазон — 2,16–37,1; р = 0,003), ніж у французькій — 3,32 (діапазон — 1,29–8,53; р = 0,01), у середньому співвідношення шансів (OR) становило 4,84 (діапазон 2,59–12,50; р = 0,0001). Отже, основною причиною відмінностей у частоті SVR виявилася результуюча багатофакторного варіаційного аналізу, що враховувала п’ять основних ознак: IL28b, стадія фіброзу (FibroTest), ступінь запалення (ActiTest), генотип вірусу та вірусне навантаження.

Відповідно до мети дослідження ми порівняли динаміку фіброзу під час ПВТ у двох групах хворих: із відсутнього (N = 110) та з наявного (N = 214) Т–-алеллю гена IL28b. Цілком прогнозовано ми констатували найбільш значне зниження ступеня фіброзу серед хворих із сприятливим CC–варіантом гена IL28b, адже саме в цій групі хворих була найвища частота SVR (87 проти 44 % при CT/TT-–генотипах). Однак, на нашу думку, більш важливими є виявлені нами відмінності в динаміці фіброзу в середині групи хворих, які досягли SVR, адже саме ці пацієнти вважаються остаточно вилікуваними і не підлягають подальшому диспансерному спостереженню. Серед осіб, які досягли стійкої авіремії, найнижчий ступінь зниження фіброзу (у середньому на 1,25 пункту за шкалою METAVIR) виявлено в носіїв Т-–алелі гена IL28b, натомість максимальне зниження фіброзу констатовано в осіб, у яких однонуклеотидний поліморфізм IL28b відповідає генотипу CC, p < 0,05 (рис. 2).

Отримані дані свідчать про те, що не всі хворі на ХГС, які досягають стійкої вірусологічної відповіді, позбуваються ризиків, пов’язаних із наслідками персистенції вірусу HCV. Дані спостереження дозволяють припустити, що в носіїв Т–-алелі в рестрикційному фрагменті rs12979860 гена IL28b навіть після елімінації вірусу гепатиту С може зберігатися підвищена активність перисинусоїдальних клітин Іто та експресія білків – інгібіторів апоптозу (таких як Bcl–-2), що підтримують процеси фіброгенезу, моно– та поліклональну проліферацію астроцитів та В-–лімфоцитів із високим ризиком В–-клітинної та гепатоцелюлярної неоплазії. Додатковими тригерами прогресування фіброзу в таких випадках, безперечно, можуть виступати ендогенні (стеатоз) та екзогенні (токсико-–аліментарні) фактори. Тому, на нашу думку, доцільним є запровадження диспансерного спостереження із моніторингом фіброгенезу (FibroTest) та канцерогенезу (α-–FP) не лише за хворими з наявним хронічним гепатитом С, але і за пацієнтами, які досягли авіремії, проте й надалі належать до груп ризику прогресування фіброзу, цирозу та гепатоцелюлярної карциноми.