Украинский журнал хирургии 1 (24) 2014
Вернуться к номеру
Роль протеїнкінази С у дисфункції тромбоцитів за умови гострих кровотеч із виразок гастродуоденальної зони
Авторы: Делій В.Ю. - Донецький національний медичний університет ім. М. Горького, м. Донецьк, Україна
Рубрики: Хирургия
Разделы: Клинические исследования
Версия для печати
З метою встановлення in vitro модулюючого ефекту протеїнкінази С (PКС) на АДФ-індуковану агрегацію тромбоцитів у хворих із виразковими кровотечами гастродуоденальної зони проведено вимірювання АДФ-індукованої агрегації тромбоцитів за умов наявності та відсутності попереднього інкубування з інгібітором PKC. Групу хворих із виразковими кровотечами гастродуоденальної зони становили 19 хворих, вік 53 ± 4 роки. Контрольну групу становили 85 осіб відповідного віку. Вимірювання агрегації тромбоцитів здійснювали спектрофотометричним методом. Для вилучення впливу розведення на результати досліджень першу кювету інкубували з фізіологічним розчином, а другу — з неселективним інгібітором протеїнкінази С (неоміцин, кінцева концентрація 20 мкМ/л). Кінцева концентрація АДФ становила 5 мкМ/л (ЕС50). Зниження АДФ-індукованої агрегації тромбоцитів за умов попереднього інкубування з інгібітором PKC було зафіксовано в 58 % випадків. Стимулюючий ефект інгібітору РКС на АДФ-індуковану агрегацію тромбоцитів був зафіксований у 31 % випадків. Відсутність же ефекту інгібітору PKC на АДФ-індуковану агрегацію тромбоцитів зафіксовано лише в 11 % випадків. Таким чином, у хворих із виразковими кровотечами гастродуоденальної зони мали місце і позитивний, і негативний модулюючі ефекти PKC на АДФ-індуковану агрегацію тромбоцитів, а також відсутність ефекту. Позитивний ефект PKC не вирішував проблеми успішної реалізації фази стабілізації тромбу, що підтверджує наявність повторної кровотечі. Проте відсутність ефекту РКС або обмежений негативний ефект РКС на АДФ-індуковану агрегацію тромбоцитів також не визначав реалізації фази стабілізації тромбу, що супроводжувалося зворотним або частково зворотним характером відповіді тромбоцитів.
С целью установления in vitro модулирующего эффекта протеинкиназы С (PКС) на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов у больных с язвенными кровотечениями гастродуоденальной зоны проведено измерение АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов в условиях наличия и отсутствия предварительной инкубации с ингибитором PKC. Группу больных с язвенными кровотечениями гастродуоденальной зоны составили 19 больных, возраст 53 ± 4 года. Контрольную группу составили 85 человек соответствующего возраста. Измерения агрегации тромбоцитов осуществляли спектрофотометрическим методом. Для исключения влияния разведения на результаты исследований первую кювету инкубировали с физиологическим раствором, а вторую — с неселективным ингибитором протеинкиназы С (неомицин, конечная концентрация 20 мкм/л). Конечная концентрация АДФ составляла 5 мкм/л (ЕС50). Снижение АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов при условии предварительного инкубирования с ингибитором PKC было зафиксировано в 58 % случаев. Стимулирующий эффект ингибитора РКС на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов был зафиксирован в 31 % случаев. Отсутствие же эффекта ингибитора PKC на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов зафиксировано только в 11 % случаев. Таким образом, у больных с язвенными кровотечениями гастродуоденальной зоны имели место и положительный, и отрицательный модулирующие эффекты PKC на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов, а также отсутствие эффекта. Положительный эффект PKC не решал проблемы успешной реализации фазы стабилизации тромба, что подтверждается наличием повторного кровотечения. Однако отсутствие эффекта РКС или ограниченный негативный эффект РКС на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов также не определял реализации фазы стабилизации тромба, что сопровождалось обратимым или частично обратимым характером ответа тромбоцитов.
It is known that platelets play a crucial role in thrombosis and haemostasis. Platelets adhere to the site of vascular injury and become activated. The protein kinase C (PKC) family is a major regulator of platelet granule secretion, integrin activation, aggregation, spreading and procoagulant activity. Members of the PKC family of serine/threonine kinases are classified into three subfamilies on the basis of the structure of their regulatory domains. Conventional (or classic) (cPKC) isoforms (α, βI/II and γ) contain a tandem C1 domain capable of binding diacylglycerol (DAG), and a Ca2+-binding C2 domain. Novel (nPKC) isoforms (δ, ε, η and θ) also contain C1 domains, but lack the ability to bind Ca2+ at the C2-like domain. Atypical isoforms (ζ and 1/λ) lack a C2 domain and have an atypical C1 domain. Human platelets highly express the conventional PKC isoforms α and β and the novel isoforms δ and θ. Early pharmacological studies, which had not been able to distinguish between different isoforms, had showed that key platelet activation processes, such as secretion, integrin αIIbβ3 activation, and aggregation, are positively regulated by PKC activity. However, there is also good evidence that PKC has a negative role in platelets, in particular by suppressing Ca2+ signal generation, for example by promoting Ca2+ extrusion and desensitizing agonist receptors. In consideration of the recent study which had showed that platelet dysfunction is one of the factors of pathogenesis of gastroduodenal ulcer bleeding the next question arised. What is effect of PKC on platelet aggregation among patients with gastroduodenal ulcer bleeding? For the purpose of in vitro estimation of PKC effect on ADP-induced platelet aggregation among patients with gastroduodenal ulcer bleeding the ADP-induced platelet aggregation was measured either with or without prior incubation with PKC inhibitor. The group of patients with gastroduodenal ulcer bleeding numbers 19 patients, aged 53 ± 4 years. The control group counts 85 volunteers of the same age. Measurement of platelet aggregation has been carried out by spectrophotometry. The inhibitor of PKC, neomycin, has been used in finite concentration 20 mkm/l. The finite concentration of ADP constituted 5 mkm/l (EC50). The distribution pattern of ADP-induced platelet aggregation in control group was statistically different from the studied index in group of patients with gastroduodenal ulcer bleeding (р = 0.005). That fact was connected with wide variability of distribution pattern of studied index among patients with gastroduodenal ulcer bleeding. The results of estimation of PKC inhibitor effect on ADP-induced platelet aggregation in control group showed statistically significant decrease of the studied index (p = 0.05). The same estimation among patients with gastroduodenal ulcer bleeding did not show statistically significant difference in the studied index (p = 0.156). The last result was consequence of the fact that positive, negative and absence of PKC effect on ADP-induced platelet aggregation was established. The prior incubation of platelets with PKC inhibitor decreased the ADP-induced platelet aggregation in 58 % of cases. The positive effect of PKC inhibitor on ADP-induced platelet aggregation was recorded in 31 % of cases. Absence of PKC inhibitor effect on ADP-induced platelet aggregation was recorded only in 11 % of cases. However, the high positive effect of PKC on ADP-induced platelet aggregation has not provided stabilization of thrombus, that was confirmed by recurrence of gastroduodenal ulcer bleeding. Moreover, neither negative nor absence of PKC effect on ADP-induced platelet aggregation has not ensured the phase of thrombus stabilization that was sustained by reversible or partly reversible character of ADP-induced platelet aggregation.
гостра кровотеча, виразки гастродуоденальної зони, тромбоцити, протеїнкіназа С.
острое кровотечение, язвы гастродуоденальной зоны, тромбоциты, протеинкиназа С.
acute bleeding, gastroduodenal ulcer, platelets, protein kinase C.
Статья опубликована на с. 76-79
Вступ
Гемостаз та формування тромбу є динамічним процесом, що вимагає наявності координованої серії подій із залученням рецепторів тромбоцитів, реверсивних внутрішньоклітинних сигналів та, як результат, звільнення великої кількості тромбоцитарних молекул, що відповідальні за прогресування тромбогенезу та моделювання запальної відповіді шляхом залучення лейкоцитів до місця дефекту судинної стінки [1, 2]. Незважаючи на це, у сучасній літературі дуже мало конкретних даних щодо параметрів функціонування тромбоцитів та їх внутрішньоклітинних систем у пацієнтів із кровотечами з виразок гастродуоденальної зони. На сьогодні достеменно відомо, що саме внутрішньоклітинні дефекти призводять до порушення усіх фаз тромбоцитарного гемостазу, тобто ініціації, прогресування та стабілізації тромбу. Так, нещодавні фармакологічні дослідження показали, що такий внутрішньоклітинний регулятор, як протеїнкіназа С (PKC), відповідальний не тільки за секрецію гранул та агрегацію, але й за активацію інтегрину αIIbβ на поверхні тромбоцитів, що є ключовою подією фази стабілізації тромбу [3, 4]. Отримані раніше дані свідчать про те, що одним із патогенетичних механізмів розвитку виразкових кровотеч є дисфункція тромбоцитів, яка проявляється в зміні їх реактивності щодо гуморальних чинників [5]. Враховуючи той факт, що усі відомі активатори агрегації тромбоцитів тим чи іншим чином реалізують свій ефект за участю PKC, закономірним є питання: яку роль за цих умов відіграє PKC? Чи впливає даний трансдуктор на реактивність тромбоцитів за умови гострих кровотеч із виразок гастродуоденальної зони, і яким є цей ефект?
Мета роботи: встановити in vitro модулюючий ефект PКС на АДФ-індуковану агрегацію тромбоцитів у хворих із виразковими кровотечами гастродуоденальної зони.
Матеріал та методи
Проведено вимірювання АДФ-індукованої агрегації тромбоцитів за умов наявності та відсутності попереднього інкубування з інгібітором PKC у хворих із виразковими кровотечами гастродуоденальної зони (19 хворих, вік 53 ± 4 роки) на момент госпіталізації. Контрольну групу становили 85 осіб відповідного віку — 53 ± 4 роки. Отримання багатої та бідної тромбоцитами плазми було проведене стандартним методом. Вимірювання агрегації тромбоцитів здійснювали спектрофотометричним методом на агрегометрі фірми Solar 2110. Для вилучення впливу розведення на результати досліджень першу кювету інкубували з фізіологічним розчином, а другу — з неселективним інгібітором протеїнкінази С (неоміцин, кінцева концентрація 20 мкМ/л). Кінцева концентрація АДФ становила 5 мкМ/л (ЕС50). Аналіз результатів проведено із залученням статистичного пакета MedStat, а саме параметричної та непараметричної статистики (критерію Стьюдента, критерію U Манна — Уїтні — Вілкоксона та Т-критерію Вілкоксона).
Результати та обговорення
Аналіз АДФ-індукованої агрегації тромбоцитів у групі контролю та хворих на виразкові кровотечі гастродуоденальної зони дозволив встановити наявність статистично значимих відмінностей (р = 0,005), що пов’язано з доволі широкою варіабельністю відповіді тромбоцитів на АДФ у хворих на виразкові кровотечі гастродуоденальної зони (рис. 1, 2).
/77/77.jpg)
Даний показник не був пов’язаний із віком, статтю, вираженістю кровотечі або оцінкою гемостазу за класифікацією Форрест. Проте визначено певні відмінності щодо відповіді тромбоцитів на АДФ у пацієнтів із різним результатом кровотечі. Порівняння відповіді тромбоцитів на АДФ у пацієнтів зі сприятливим результатом та розвитком повторної кровотечі показало, що за відсутності статистично значимих відмінностей (р = 0,576) АДФ-індукована агрегація тромбоцитів у пацієнтів без повторної кровотечі була дещо вищою (М = 45,67 ± 17,80 %) за показник у пацієнтів із рецидивом кровотеч (М = 34,8 ± 8,6 %).
Аналіз результатів дослідження впливу інгібітору PKC на АДФ-індуковану агрегацію тромбоцитів у групі контролю дозволив встановити статистично значиме зниження відповіді (p = 0,05). Цікаво, що аналогічні умови інкубації в групі хворих із виразковими кровотечами не призводили до змін АДФ-індукованої агрегації тромбоцитів (p = 0,156). Такий результат може бути пов’язаний як із нівелюванням ролі РКС у регуляції функціонального стану тромбоцитів, так і зі змінами рівня експресії різних ізоформ РКС у тромбоцитах за умов виразкової хвороби.
Як відомо, протеїнкінази С (PКС) — це сімейство серин-треонінових кіназ, що складаються з декількох ізоформ та відповідальні за значну частину процесів фосфорилювання в багатьох типах клітин, у тому числі в тромбоцитах. Розрізняють такі класи протеїнкіназ С:
— типові (conventional, cPKC) форми (α, βI, βII, γ), що активуються Ca2+/діацилгліцеролом;
— нещодавно відкриті (novel, nPKC) форми (δ, ε, η, θ), що активуються лише діацилгліцеролом;
— атипові (atypical, aPKC) форми (ζ, ι/λ), що є діацилгліцерол-незалежними [5].
Тромбоцити людини в значній кількості експресують РКСα, РКСβ, РКСδ, РКСθ [6]. Відомо, що АДФ активує внутрішньоклітинний каскад реакцій із залученням PLCβ, яка каталізує утворення діацилгліцеролу (DAG) та інозитол-3-фосфату (I3P). Це призводить до підвищення концентрації Са2+. Остання подія є тригером активації типових ізоформ PKC, що, однак, не виключає наявність позитивних та негативних зворотних зв’язків та залучення nPKC у процес вивільнення Са2+ із внутрішньоклітинних депо, а також вхід Са2+ до тромбоцита з позаклітинного простору [3]. Зокрема, деякі дослідники наполягають на негативній регуляції PKC функціонального стану тромбоцитів. Даний ефект реалізується за рахунок зниження внутрішньоклітинної концентрації Ca2+ [7] та десенситизації рецепторів [6]. З огляду на різноманіття ізоформ РКС, експресованих у тромбоцитах, та визначену широку варіабельність відповіді тромбоцитів на АДФ у хворих із виразковими кровотечами доцільно було визначитися, чи є однаковим модулюючий ефект РКС у хворих із виразковими кровотечами.
Аналіз варіаційних рядів показав, що попереднє інкубування тромбоцитів з інгібітором PKC у групі хворих на виразкові кровотечі визначає різноспрямовані зміни АДФ-індукованої агрегації тромбоцитів. Якщо в одних хворих зафіксовано зниження відповіді тромбоцитів, то в інших — зростання відповіді тромбоцитів на АДФ. До того ж було зафіксовано декілька випадків повної відсутності ефекту інгібітору PKC на АДФ-індуковану агрегацію тромбоцитів. Така варіабельність змін, враховуючи факт використання неселективного інгібітору PKC, може відбивати експресію в тромбоцитах різних хворих відмінних наборів ізоформ РКС, що різною мірою залучені до реалізації функціональної відповіді тромбоцитів.
У пошуку причинно-наслідкових зв’язків було проведено аналіз клініко-лабораторних паралелей у хворих із різними ефектами інгібітору РКС на АДФ-індуковану агрегацію тромбоцитів. Зниження АДФ-індукованої агрегації тромбоцитів за умов попереднього інкубування тромбоцитів з інгібітором PKC було зафіксовано в 11 хворих (58 % випадків). Вираженість ефекту інгібітору PKC у реалізації тромбоцитарної відповіді не була пов’язана з давністю кровотечі та статусом гемостазу за Форрестом. Аналіз зв’язків між ефектом інгібітору PKC та результатом кровотечі дозволив визначити, що рецидив кровотечі був завжди асоційований зі значним зниженням відповіді тромбоцитів на АДФ за умов попереднього інкубування з інгібітором PKC. Модулюючий ефект інгібітору РКС при цьому становив М = 40,27 ± 5,63 %. Цей факт є прямим свідченням того, що:
1) з одного боку, агрегаційна відповідь тромбоцитів у хворих на виразкові кровотечі значною мірою може реалізовуватися за участю PKC;
2) відповідь на АДФ не є гарантією стабільного гемостазу. Більше того, зростання ролі РКС у реактивності тромбоцитів може бути пов’язане з ризиком розвитку повторної кровотечі.
Стимулюючий ефект інгібітору РКС на АДФ-індуковану агрегацію тромбоцитів був зафіксований лише в 6 хворих (31 % випадків). Цікаво, що такий ефект був асоційований із відсутністю відповіді тромбоцитів на АДФ (за умов відсутності інкубації з інгібітором РКС). Отже, інкубування тромбоцитів з інгібітором РКС відміняло негативний ефект РКС на АДФ-індуковану агрегацію. Даний факт може бути пов’язаний з участю PKC у десенситизації G-протеїн-зв’язаних рецепторів, зокрема пуринових [6]. Таким чином, порушення реакції тромбоцитів на АДФ та інші гуморальні чинники у хворих із гострими виразковими кровотечами може бути зумовлене модулюючим ефектом РКС. Однак треба зазначити, що підвищення відповіді тромбоцитів на АДФ за умов попереднього інкубування з інгібітором РКС не вирішувало проблеми успішної реалізації фази стабілізації тромбу, що за наявності нормального рівня фібриногену в плазмі чітко вказує на порушення експозиції інтегринів αIIβb3 на поверхні тромбоцитів. Поданий факт підтверджується зворотним або частково зворотним характером агрегаційної відповіді тромбоцитів на АДФ за умов попереднього інкубування з інгібітором протеїнкінази С.
Хоча відсутність ефекту інгібітору PKC на АДФ-індуковану агрегацію тромбоцитів зафіксовано лише у двох пацієнтів (11 %), це супроводжувалося незначною відповіддю тромбоцита на АДФ та рецидивом кровотечі в кожному з випадків.
Таким чином, у частини хворих із виразковими кровотечами гастродуоденальної зони мав місце значний позитивний вплив РКС у АДФ-індукованій агрегації тромбоцитів, який, однак, не вирішував проблеми успішної реалізації фази стабілізації тромбу, що підтверджувалося наявністю повторної кровотечі. Проте відсутність ефекту РКС або обмежений негативний ефект РКС також не визначав реалізації фази стабілізації тромбу, що супроводжується зворотним або частково зворотним характером відповіді тромбоцита на АДФ.
Висновок
У роботі виявлено гетерогенний вплив інгібітору PKC на АДФ-індуковану агрегацію тромбоцитів у хворих на виразкові кровотечі гастродуоденальної зони. Такий результат може свідчити про експресію різних ізоформ РКС у тромбоцитах хворих із виразковими кровотечами та їх роль у порушенні гемостазу за умов хронічного запально-деструктивного процесу. Подальше вивчення молекулярних механізмів дисфункції тромбоцитів у хворих із гострими кровотечами дозволить розробити стратегію патогенетично обґрунтованої корекції порушень гемостазу.
1. Баринов Э.Ф. Молекулярные механизмы тромбогенеза / Э.Ф. Баринов, О.Н. Сулаева // Кардиология. — 2012. — № 12. — С. 45–56.
2. Amrei S. Dual role of platelet protein kinase c in thrombus formation: stimulation of pro-aggregatory and suppression of procoagulant activity in platelets / S. Amrei, I.C.A. Munnix, J. Marijke // J. Biol. Chem. — 2007. — Vol. 282. — P. 7046–7055.
3. Harper M.T. Diverse functions of protein kinase C isoforms in platelet / M.T. Harper, A.W. Poole // J. Thromb. Haemost. — 2010. — Vol. 8(3). — P. 454–462.
4. Kunapuli S.P. Protein kinase C- and calcium-regulated pathways independently synergize with Gi pathways in agonist-induced fibrinogen receptor activation / S.P. Kunapuli, J.L. Daniel // Biochem. J. — 2002. — Vol. 368 (Pt 2). — P. 535–543.
5. Platelet aggregation measurement for assessment of hemostasis failure mechanisms in patients with gastroduodenal ulcer bleeding / E. Barinov, O. Sulaieva, Y. Lyakch [et al.] // Clin. Exp. Gastroenterol. — 2013. — Vol. 6. — P. 139–148.
6. P2Y1 and P2Y12 receptors for ADP desensitize by distinct kinase-dependent mechanisms / A.R. Hardy, P.B. Conley, J. Luo [et al.] // Blood. — 2005. — Vol. 105(9). — P. 3552–3560.
7. Rarker P.J. PKC at a glance / P.J. Rarker, J. Murray-Rust // J. Cell. Sci. — 2004. — Vol. 117 (Pt 2). — P. 131–132.
8. Functional Divergence of Platelet Protein Kinase C (PKC) Isoforms in Thrombus Formation on Collagen / K. Gilio, M.T. Harper, M. Cosemans [et al.] // J. Biol. Chem. — 2010. — Vol. 285. — P. 23410–23419.