Журнал «Здоровье ребенка» 1 (52) 2014

Статья опубликована на с. 27-31

Бронхиальная астма (БА) в связи с достаточно широкой распространенностью (в некоторых странах страдает до 1–18 % популяции [1, 2]) и ростом в последние годы (до 2–2,5 раза [1, 3]) по-прежнему является одной из глобальных проблем здравоохранения. Проблема особенно актуальна для педиатрии в связи с более тяжелыми по сравнению со взрослыми пациентами течением и последствиями болезни [2, 5]. Для Украины проблема также сохраняет актуальность в связи с тем, что в нашей стране среди детей заболеваемость БА, по ряду оценок, достигает 15 % [4, 5].

Развитие симптомокомплекса бронхиальной астмы — типичного мультифакториального заболевания — зависит от сочетанного влияния многих факторов, обеспечивающих функционирование слизистой респираторного тракта [6–8]. Продукт секреции клеток Клара — секретоглобин SCGB1A1 (утероглобин СС16) — один из таких факторов, влияющих на функционирование слизистой, генетический полиморфизм которого ассоциируется с развитием данной патологии. Эта белковая молекула с небольшим молекулярным весом (16 тыс. D), синтезируемая у млекопитающих эпителиальными клетками дистальных бронхиол (клетками Клара), существует в виде гомодимера, с двумя дисульфидными связями между субъединицами, и обладает выраженным иммуномодулирующим и противовоспалительным действием [9, 10]. Ген секретоглобина SCGB1A1, длиной 4172 нуклеотида, расположен в 11-й хромосоме (11q12.2) и содержит три экзона [11, 12], первый из экзонов, нетранслируемый, входит в состав так называемого downstream promoter element (DPE). Для гена секретоглобина описано несколько видов полиморфизма, один из которых — А(38)G (замена А на G в 38-м положении первого экзона) — ассоциируется с повышенной вероятностью развития БА [12–14]. В связи с тем, что степень генетического полиморфизма в различных этногеографических группах населения может довольно значительно различаться, целью настоящего исследования и явилось определение степени полиморфизма А(38)G гена SCGB1A1 у детей в крымской популяции для выяснения возможной взаимосвязи между степенью данного полиморфизма и развитием БА.

Материалы и методы

Исследовались образцы ДНК, полученные от детей, страдающих бронхиальной астмой, рецидивирующим бронхитом (РБ) и здоровых. Всего на настоящий момент обследовано 114 детей в возрасте от 6 до 16 лет (средний возраст 12,4 ± 3,0 года).

Группа больных БА составила 75 человек (51 мальчик (68 %), 24 девочки (32 %)). Из них 63 % больных (47 детей) находились в состоянии ремиссии и 37 % (28 детей) — в состоянии обострения. У 38 пациентов (51 %) диагностирована интермиттирующая БА, у 26 пациентов (34,5 %) — легкая персистирующая БА, у 11 (14,5 %) — средней тяжести персистирующая БА. Диагноз ставился в соответствии с протоколом диагностики и лечения БА [8].

Группа больных рецидивирующим бронхитом без эпизодов обструкции составила 19 человек, а контрольная группа здоровых детей без пульмонологической патологии — 20 человек.

Образцы ДНК для исследования выделяли из периферической крови и слюны обследуемых методом фенол-хлороформной экстракции [15].

Исследование А(38)G-полиморфизма проводилось с помощью полимеразной цепной реакции методом аллельной дискриминации в соответствии с работой [16], с использованием системы из трех праймеров — двух прямых аллелеспецифических, различающихся по 3-концевому нуклеотиду: прямой 1 5`CAgAgACggAACCAgAgACA, прямой 2 5`AgAgACggAACCAgAgACg, и общего обратного праймера 5`TCCTgAgAgTTCCTAAgTCC. Синтез праймеров осуществлен в НПФ «Синтол», Россия.

Полимеразная цепная реакция проводилась в объеме 25 мкл в двух пробирках, в одной из которых находился прямой праймер 1 и обратный праймер, во второй — прямой праймер 2 и обратный праймер. После проведения амплификации и последующего электрофореза в 3% агарозном геле в присутствии бромистого этидия проводилась детекция результатов амплификации в ультрафиолетовом свете [17]. У гомозигот эффективная амплификация происходила только в одной из пробирок, что регистрировалось по наличию флуоресцирующей зоны в одном из амплифицированных образцов, у гетерозигот эффективная амплификация происходила в обеих пробирках и флуоресцирующие зоны регистрировались в обоих образцах. Вычислялись частоты аллелей и частоты аллельных сочетаний и их соответствие равновесию Харди — Вайнберга по критерию ^x2 с расчетными, отвергая нулевую гипотезу при Р < 0,05 [18, 19].

Результаты и обсуждение

Частоты встречаемости аллельных вариантов A(38)G у различных групп обследованных детей приведены в табл. 1.

Из данных табл. 1 видно, что во всех группах обследованных более распространена аллель G, составляющая 63–69 %, в то время как аллель А составила 31–37 %. Достоверные различия в частотах встречаемости аллелей А и G исследованного локуса в исследованных группах не выявлены, хотя и наблюдается некоторая тенденция.

Из данных табл. 2 видно, что частоты встречаемости аллельных вариантов в группе больных бронхиальной астмой и в контрольной группе статистически не отличаются от ожидаемых величин, т.е равновесие Харди — Вайнберга внутри этих групп не нарушено. Однако в группе больных рецидивирующим бронхитом наблюдаются значительные достоверные различия между наблюдаемыми и ожидаемыми частотами встречаемости всех аллельных вариантов. Так, частоты гомозиготных аллельных сочетаний как АА, так и GG значительно увеличены, а гетерозиготное аллельное сочетание АG встречается чрезвычайно редко. Практически 90 %пациентов, при ожидаемых 44 %, в этой группе демонстрируют гомозиготное состояние.

Из данных табл. 3 видно, что по частоте аллельных сочетаний наблюдаются выраженные различия. Наименее выражены различия между больными с бронхиальной астмой и контрольной группой.

Достоверные различия наблюдаются только по аллельному сочетанию АА, которое у пациентов с астмой встречалось достоверно реже. Гораздо более выражены различия между группой больных рецидивирующим бронхитом и контрольной группой и особенно между группами больных бронхиальной астмой и рецидивирующим бронхитом — частота встречаемости гомозиготного аллельного сочетания АА значительно выше, а гетерозиготного AG — значительно ниже. Значительно выраженные различия между группами больных бронхиальной астмой и рецидивирующим бронхитом проявляются также в частотах гомозиготного аллельного сочетания GG, достоверно более частого у пациентов с рецидивирующим бронхитом, в то время как разница при сравнении с контрольной группой недостоверна.

Из сопоставления данных табл. 1–3 видно, что хотя по частоте аллелей выраженных различий между исследованными группами нет, с некоторой недостоверной тенденцией большей встречаемости аллели А у пациентов с рецидивирующим бронхитом и в контрольной группе по сравнению с больными бронхиальной астмой и при отсутствии достоверных различий в частотах встречаемости аллельных сочетаний в контрольной группе и у больных бронхиальной астмой, в группе пациентов с рецидивирующим бронхитом регистрируются значительные отличия в частотах аллельных сочетаний от равновесных, т.е. имеет место значительное нарушение равновесия Харди — Вайнберга. То, что носители гетерозиготного варианта AG встречаются в группе пациентов с рецидивирующим бронхитом настолько редко, может быть либо следствием сниженной жизнеспособности их носителей (что требует исследования достаточно больших выборок), либо результатом неоднородности самой исследуемой группы, множественных причин возникновения данного патологического состояния, а также небольшого количества случаев в исследованной выборке.

Различия в частотах встречаемости аллельных сочетаний становятся особенно выраженными при сравнении между исследованными группами. Наиболее выражены различия в частоте встречаемости гомозиготного варианта АА — частота достоверно выше у пациентов с рецидивирующим бронхитом и достоверно ниже у пациентов с бронхиальной астмой по сравнению с контрольной группой. Между группами пациентов с бронхиальной астмой и контрольной группой по другим аллельным сочетаниям достоверных различий нет. Но у группы пациентов с рецидивирующим бронхитом наблюдаются весьма высокие различия по частотам всех трех аллельных сочетаний как с контрольной группой, так и особенно с группой пациентов с бронхиальной астмой. В данном случае, как и при анализе отклонения частот аллельных сочетаний от равновесного, это может быть следствием небольшого числа случаев в исследованной выборке, а также может являться результатом этиопатогенетической неоднородности случаев внутри самой выборки. Так или иначе, обнаруженное явление нуждается, на наш взгляд, в дальнейшем исследовании.

Выше отмечалось, что в группе пациентов с бронхиальной астмой частота аллели А несколько ниже, а частота гомозиготного аллельного сочетания АА достоверно ниже, чем аналогичные показатели в контрольной группе, то есть из приведенных данных видно, что однонуклеотидный A(38)G-полиморфизм взаимосвязан с заболеваемостью бронхиальной астмой. Это согласуется с известными литературными данными, показывающими, что A(38)G-полиморфизм ассоциирован с возникновением и течением ряда патологических состояний, в патогенезе которых играет роль иммунная система. Так, отмечалось, что указанный полиморфизм, кроме влияния на заболеваемость и течение астмы, ассоциируется также с заболеваемостью саркоидозом [16], атопическим дерматитом [20], онкопатологией [9, 21] и др.

Относительно встречаемости различных полиморфных вариантов A(38)G-полиморфизма в популяции в литературе существует ряд противоречивых мнений. Так, в ряде работ [22] не было обнаружено взаимосвязи между развитием патологического процесса и данным видом полиморфизма, в ряде работ такая взаимосвязь обнаруживалась, однако характер генетической изменчивости наблюдался разный: в работе [23] у пациентов с бронхиальной астмой частота гомозиготного аллельного сочетания АА была выше, в то время как в работах [24, 25] регистрировалась обратная картина. Более однозначные данные касались взаимосвязи между аллельными вариантами A(38)G, уровнем секретоглобина SCGB1A1 и тяжестью астматических проявлений — гомозиготы АА имели меньший уровень циркулирующего секретоглобина и более тяжелое течение астмы [12, 25]. Также в литературе неоднократно отмечалось, что степень A(38)G-полиморфизма гена секретоглобина отличается в различных этногеографических популяциях [16, 23, 25]. Не исключено, что как популяционные различия, так и различия в оценке тяжести и особенностей течения астматического процесса могут влиять на получаемые результаты. Обнаруженные нами особенности A(38)G-полиморфизма у детей, больных бронхиальной астмой, говорят о перспективности данного направления исследований, продолжение которого с учетом тяжести процесса, а также во взаимосвязи с уровнем циркулирующего секретоглобина SCGB1A1 (утероглобина СС16) позволит лучше понять природу воспалительного процесса и возможности влияния на него при бронхиальной астме.

Выводы

1. В крымской популяции регистрируется A(38)G-полиморфизм в первом экзоне секретоглобина SCGB1A1.

2. Частоты аллельных сочетаний генетических вариантов данного полиморфизма отличаются у больных бронхиальной астмой, рецидивирующим бронхитом и в контрольной группе. Частота гомозигот АА среди больных бронхиальной астмой ниже, а среди больных рецидивирующим бронхитом выше, чем в контрольной группе.

3. Частота гетерозигот AG среди больных рецидивирующим бронхитом ниже, чем гомозигот АА и GG.