Журнал «Здоровье ребенка» 1 (52) 2014

Статья опубликована на с. 164-169

Эпштейна — Барр вирусная инфекция (ЭБВИ) является инфекционной болезнью иммунной системы с хронической персистенцией вируса. Вирус Эпштейна — Барр (ЭБВ) обладает тропизмом к различным клеткам, но основной мишенью для него являются В-лимфоциты и дендритные клетки, несущие на себе рецептор CD21 (или CR2-рецептор для C3d-компонента системы комплемента) [1–3]. Он может также поражать эпителий слизистой носо- и ротоглотки, протоков слюнных желез, шейки матки, желудочно-кишечного тракта, эндотелий сосудов, гладкомышечных клеток [4, 5]. Также есть сообщение о возможном инфицировании вирусом иммунокомпетентных клеток — Т-лимфоцитов (CD3), клеток естественных киллеров (NK-клетки — CD16), макрофагов, моноцитов, нейтрофилов [6, 7]. При ЭБВ-инфекции можно наблюдать иммунологический образ, присущий персистирующим инфекциям в целом.

Разные авторы описывают различные изменения со стороны всех звеньев иммунитета при ЭБВИ, очень часто даже противоречивые [8–10]. Так, G. Niedobitek et al. отмечают отсутствие достоверных изменений уровня В-лимфоцитов с фенотипом CD20+ у детей с инфекционным мононуклеозом (ИМ) разной степени тяжести по сравнению со здоровыми детьми и между собой [11]. В исследованиях Y. Kasahara, A. Yachie, S. Ohga et al. отмечалось повышение концентрации В-клеток CD21+ в первые 3 недели болезни у детей с более тяжелым течением ИМ [4, 12]. Об увеличении количества В-лимфоцитов (с фенотипом CD72+) в эти же сроки говорится и в других работах [5, 13]. В литературе есть данные о снижении содержания в периферической крови клеток с фенотипом CD19+ (В-лимфоциты) и CD19+CD23+ (зрелые В-лимфоциты) в острую фазу ИМ и в периоде ранней реконвалесценции, причем степень выраженности этого уменьшения и его продолжительность прямо коррелировали с тяжестью заболевания [14]. При острой ЭБВ-инфекции также происходят значительные изменения со стороны Т-клеточного иммунитета, проявляющиеся нарушениями в содержании и уровне функциональной активности Т-лимфоцитов. Эти изменения, по данным разных авторов, также носят разнонаправленный характер [1, 8, 14]. Так, в работах L.S. Zidovec et al., В.В. Новицкого и соавт. указывается на повышение при острой ЭБВИ относительного и/или абсолютного уровня Т-лимфоцитов (CD3+-клеток) [15, 16]. Другие исследователи отмечают некоторое снижение содержания клеток с данным фенотипом в острый период ИМ [5, 13]. Изменения субпопуляционного состава Т-лимфоцитов в доступной нам литературе также описываются по-разному. Повышенное содержание (или тенденция к повышению содержания) CD4+-клеток в острый период ИМ и в период ранней реконвалесценции показано в работах Y. Kasahara et al., G. Niedobitek et al., L. Quintanilla-Martinez et al. [11, 12, 17]. В исследованиях D.H. Crawford, В.А. Кельцева и соавт., В.В. Новицкого и соавт. обнаружено, что уровень этих клеток при остром ИМ не изменяется или снижается [10, 14, 16]. В отношении содержания Т-лимфоцитов с фенотипом CD8+ данные различных исследователей также противоречивы. Большинство авторов указывает на повышение уровня этих клеток в острую фазу ИМ [10, 13, 14, 16]. При этом отмечается увеличение содержания активированных Т-лимфоцитов с фенотипом CD8+CD38+ и CD8+HLA-DR+ [14, 16]. Причем если инфекция переходит в хроническую форму, маркеры активности CD8+-клеток сохраняются и через 4 месяца от начала острой ЭБВ-инфекции [18]. Однако существуют работы, в которых отмечается тенденция к уменьшению содержания CD8+-клеток при острой ЭБВ-инфекции или зависимость этого показателя от тяжести заболевания: при легкой форме ИМ уровень CD8+-клеток повышен, а при тяжелой — снижен [4, 12]. Разбалансированность в работе клеточного иммунитета проявляется также повышением в крови клеток-предшественников кортикальных тимоцитов (CD3+CD4+CD8+) в острую фазу ИМ, различным соотношением среди Т-лимфоцитов клеток с фенотипом CD45RO+ (клетки памяти) и CD45RА+ (зрелые неиммунные, или «наивные», лимфоциты) [5, 10]. Популяция больших незрелых тимоцитов (с фенотипом CD3+CD4+CD8+) экспрессирует рецептор CD21+. Очевидно, это способствует инфицированию этих клеток вирусом и объясняет способность ЭБВ поражать Т-лимфоциты на ранних этапах Т-лимфопоэза, еще в тимусе [13]. По содержанию еще одних эффекторных клеток — естественных киллеров, или NK-клеток (CD16+), также существуют противоречивые данные. В некоторых исследованиях указывается на повышение (абсолютное и/или относительное) уровня этих клеток в острый период ИМ [5, 13, 17]. Другие авторы констатировали снижение содержания NK-клеток в тот же период заболевания, причем более выраженное при тяжелом течении ИМ [4, 12].

ЭБВ модулирует как функционирование системы естественной цитотоксичности, так и иммуногенез, что может помогать вирусу избегать действия защитных факторов организма человека.

С учетом всего вышеизложенного целью нашего исследования было изучить состояние Т- и В-клеточного иммунитета у больных с острой ЭБВ-инфекцией и провести коррекцию выявленных изменений путем использования мультипробиотика, который представляет собой симбиотическую ассоциацию бактерий рода Bifidobacterium, Lactobacillus, Propionibcterium и Lactococcus. В зависимости от вида мультипробиотик содержит от 14 до 25 штаммов пробиотических бактерий в концентрации от 10⁹ до 10¹³ живых клеток в одной дозе препарата [19].

Материалы и методы исследования

Под нашим наблюдением находилось 185 детей, больных инфекционным мононуклеозом ЭБВ-этиологии, в возрасте 6–18 лет, проходивших лечение в городской детской клинической инфекционной больнице г. Киева в течение последних семи лет. Диагноз устанавливался на основании типичной клинической картины заболевания. В план обследования входило определение специфических антител к ЭБВ — иммуноглобулинов классов М и G к капсидному антигену (VCA), IgG к раннему антигену (EA), IgG к ядерному антигену (EBNA) методом иммуноферментного анализа (ИФА) в сыворотке крови с использованием диагностической иммуноферментной системы «Вектор-Бест», Россия. Полимеразная цепная реакция использовалась для обнаружения ДНК ЭБВ в крови и слюне («Вектор-Бест», Россия).

Исследование экспрессии дифференцировочных маркеров CD проводилось в лаборатории иммунологии Международного центра астрономических и медико-экологических исследований Национальной академии наук Украины (заведующая лабораторией иммунологии — Тарадий Н.Н., к.м.н.) и включало изучение экспрессии антигенов: CD3+ (Т-лимфоциты), CD4+ (Т-хелперы), CD8+ (супрессорно-цитотоксическая субпопуляция, цитотоксические Т–лимфоциты (ЦТЛ)), CD7+ (Т–лимфоциты, FcµR–маркер), CD16+ (естественные киллеры, или NK-клетки), CD20+ (В-лимфоциты), CD22+ (В-лимфоциты), CD25+ (IL–2R), Т-лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности рецептор к интерлейкину-2 (IL-2), CD45RA+ (зрелые неиммунные, или «наивные», лимфоциты), CD95+ (Fas/Apo, маркер апоптоза). Состояние Т- и В-клеточного звена иммунитета определяли в остром периоде болезни.

Референтные значения (n = 15) исследовали в группе сравнения, в которую вошло 15 практически здоровых детей в возрасте от 6 до 18 лет. При отборе детей в эту группу учитывали анамнестические данные: отсутствие на протяжении последних трех месяцев любых заболеваний, вакцинации и инъекции биологически активных препаратов. В разработку не включались дети с признаками гипогаммаглобулинемии, проявлениями аллергических и хронических заболеваний.

Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием современных методов медицинской статистики. Статистическую обработку результатов исследования проводили с помощью MS Excel 2007 [20].

Результаты исследования и их обсуждение

При иммунологическом обследовании детей с ЭБВ-инфекцией отмечались изменения как в Т-, так и в В-клеточном звеньях иммунитета. Состояние Т-клеточного звена иммунитета характеризовалось у детей с острым течением ЭБВ-инфекции значительным дисбалансом, признаками активации противовирусных механизмов защиты и признаками нарушения регуляции иммунной системы (рис. 1).

Достоверно, по сравнению с группой сравнения, повышен общий уровень лимфоцитов за счет относительного и абсолютного увеличения содержания Т- и В-лимфоцитов. Повышенный уровень экспансии CD3+-клеток (Т-лимфоциты) отмечается в первую очередь за счет увеличения экспрессии дифференцировочных маркеров CD95+ (Fas-лиганд), CD45RA+ (зрелые неиммунные, или «наивные», лимфоциты), CD25+ (IL-2R), CD4+-клеток (Т-хелперы) и Т-лимфоцитов CD7+ (FcµR-маркер) (p < 0,05). Со стороны экспрессии дифференцировочных маркеров клеток, вносящих основной вклад в противовирусную защиту организма от ЭБВ — CD8+-клеток (ЦТЛ) и CD16+-клеток (NK-клетки), имеет место следующая ситуация: уровень экспрессии CD16+-клеток повышен (p < 0,01), а уровень экспрессии цитотоксических Т-лимфоцитов CD8+ снижен (p < 0,05). Показатели В-клеточного иммунитета при острой ЭБВИ также изменяются и характеризуются повышением уровня экспрессии дифференцировочных маркеров В-лимфоцитов — CD20+ и CD22+ (p < 0,05). Таким образом, у обследованных нами детей с острой ЭБВ-инфекцией мы наблюдали изменения со стороны экспрессии дифференцировочных маркеров, характеризующих состояние Т- и В-клеточного иммунитета, которые мы расцениваем как проявления иммунной дисфункции, по Т-клеточному типу и проявления выраженной активации противовирусной защиты — больше по В-клеточному типу.

Повышение численности лимфоцитов в периферической крови при острой ЭБВ-инфекции происходит как за счет экспансии клеток костномозгового происхождения — NK-клеток СD16, В-лимфоцитов СD20 и СD22, так и за счет повышения уровня экспрессии дифференцировочных маркеров Т-лимфоцитов (СD3-клетки). Через СD7 (FcµR)-маркер осуществляется повышение внутриклеточной концентрации ионов кальция, перекрестное реагирование с СD25 (IL-2R), СD71, СD54, HLA-DR, стимуляция секреции интерферона (ИФН-γ), повышается цитотоксическая активность NK-клеток, инициируется пролиферация NK-клеток и опосредуется адгезия к фибронектину. При острой ЭБВ-инфекции происходит значительное повышение экспрессии маркера апоптоза (СD95/Fas) Fas-лиганда, который связывается с Fas-рецептором на активированных Т-лимфоцитах и запускает тем самым апоптоз последних. Уровень экспрессии дифференцировочных маркеров стимулированных лимфоцитов — СD45RA и высокоаффинного рецептора IL-2 СD25 (IL-2R) отражает интенсивность иммунного ответа: повышение количества этих клеток соответствует высокой активности иммунного ответа, что соответствует острой фазе инфекционного процесса и выраженному инфекционному воспалению [1].

При острой ЭБВ-инфекции за счет выраженной антигенной нагрузки происходит активация антиген-специфических и антиген-неспецифических механизмов иммунитета, связанных с естественными киллерами и В-клетками. Антиген-неспецифический механизм иммунитета является, с одной стороны, малоэффективным для элиминации ЭБВ-антигенов, с другой стороны, является основой формирования аутоиммунных реакций и лимфопролиферативных заболеваний в отдаленном катамнезе, после перенесенной острой ЭБВ-инфекции [2, 8]. Значимость экспрессии дифференцировочных маркеров естественных киллеров (СD16-клетки) объясняется тем, что эти клетки занимают важнейшее место в противоинфекционной и противоопухолевой защите и тесно связаны с аутоиммунными цитотоксическими и лимфопролиферативными процессами [4, 12]. CD16-клетки относят иммунокомпетентные клетки (ИКК) не к  рециркулирующим между кровью и лимфой клеткам, а к циркулирующим только в крови, которые могут додифференцироваться в зрелые формы при циркуляции в кровяном русле. Кроме рецепторов для цитокинов, на мембране естественных киллеров размещаются рецепторы для антигенов МНС-1 и рецептор для Fc-концов — IgG-FcyRІІІА (CD16) — единственный из ингибиторных, работающий с растворимыми лигандами. Естественные киллеры CD16 участвуют в распознавании антигенов непептидной природы в комплексе с молекулами СD1, вырабатывают интерлейкин-4 (IL-4) и через стимуляцию дифференцировки Th0 в Th2 активируют гуморальный иммунный ответ; они также экспрессируют большое количество Fas-лиганда (CD95), который связывается с Fas-рецептором на активированных Т-лимфоцитах и запускает апоптоз этих клеток [4, 12]. Увеличение уровня экспрессии дифференцировочных маркеров В-лимфоцитов при острой ЭБВ-инфекции, с одной стороны, может быть компенсаторным, с другой — может свидетельствовать о том, что активной элиминации ЭБВ-инфицированных (ЭБВ+) В-лимфоцитов не происходит (может быть, за счет снижения уровня экспрессии дифференцировочного маркера ЦТЛ (СD8-клетки)).

Из изученных показателей Т- и В-клеточного иммунитета, с нашей точки зрения, предикторами перехода острой ЭБВ-инфекции в хроническую форму выступают: уровень экспрессии Т-лимфоцитов CD8+, естественных киллеров CD16+, CD95+ (Fas-лиганд, маркер апоптоза), В-лимфоцитов CD20+ и CD22+. Именно уровень экспрессии дифференцировочных маркеров этих клеток в остром периоде и в динамике болезни свидетельствует о переходе острой инфекции в хроническую.

В связи с тем, что у всех обследуемых пациентов с острой ЭБВ-инфекцией были выявлены изменения со стороны экспрессии всех исследуемых дифференцировочных маркеров Т- и В-клеточного иммунитета, с целью коррекции выявленных нарушений дети, участвующие в исследовании, получали мультипробиотик по 1 пакетику 1 раз в день в течение 1 месяца. Все дети получали базисную терапию, которая включала антибактериальные, антигистаминные препараты, энтеросорбенты, симптоматическую и местную терапию, при необходимости — дезинтоксикационную инфузионную терапию с включением глюкозо-солевых растворов. Параметры иммунитета у детей исследовали через 1 месяц от начала терапии.

Мы провели оценку влияния разработанной схемы терапии у детей с включением мультипробиотика на иммунологические показатели с помощью метода однофакторного дисперсионного анализа и получили данные, представленные на рис. 2.

Через 1 месяц от начала терапии у детей с острой ЭБВ-инфекцией отмечали, что уровень экспрессии CD4+-Т-лимфоцитов-хелперов, CD8+–Т–лимфоцитов (ЦТЛ), CD7+-Т-лимфоцитов (FcµR-маркер), дифференцировочных маркеров активированных лимфоцитов — CD25+ (IL-2R), CD45RA+ (зрелые неиммунные лимфоциты) и CD95+ (Fas-лиганд, маркер апоптоза) приблизился к показателям у детей из группы сравнения (р > 0,05). Уровень экспрессии дифференцировочных маркеров остальных ИКК — CD3+-лимфоцитов (общий пул лимфоцитов за счет как Т-, так и В-лимфоцтитов), CD16+-клеток (NK-клетки — естественные киллеры), В-лимфоцитов CD20+ и CD22+ — оставался повышенным по сравнению с группой сравнения (р < 0,05) (рис. 2). В динамике заболевания на фоне проведенной терапии с включением мультипробиотика у наших пациентов регистрировали следующие изменения: уровень экспрессии дифференцировочного маркера CD3+–лимфоцитов, отображающий общее количество Т- и В-лимфоцитов, сохранялся повышенным и составил 1,58 ± 0,08 г/л по сравнению с аналогичным показателем при поступлении — 1,53 ± 0,05 г/л (р > 0,05). Уровень экспрессии дифференцировочных маркеров основных клеток, принимающих участие в противовирусной защите, — CD4+-Т-лимфоцитов-хелперов, CD7+-Т-лимфоцитов (FcµR-маркер), соответствующий выраженной воспалительной реакции как со стороны иммунной системы, так и со стороны всего организма, снижался в 2 раза по сравнению с этими же показателями при поступлении (p < 0,05). Уровень экспрессии цитотоксических Т-лимфоцитов — CD8+-Т-лимфоцитов в динамике на фоне терапии повысился и достиг показателя 0,68 ± 0,06 г/л по сравнению с уровнем при поступлении — 0,43 ± 0,03 г/л (р < 0,05) (рис. 2). Уровень экспрессии дифференцировочных маркеров В-лимфоцитов CD20+ и CD22+ на фоне проведенной терапии снизился в 2 раза по сравнению с аналогичным уровнем при госпитализации (р < 0,05). Уровень экспрессии натуральных киллеров, принимающих активное участие в противовирусной защите и являющихся предиктором перехода острой ЭБВ-инфекции в хроническую, у исследуемых детей также снизился в 2 раза (p < 0,05) (рис. 2). Уровень экспрессии дифференцировочных маркеров активированных ИКК снизился: CD25+-лимфоцитов (IL–2R) — в 3 раза, CD45RA+-лимфоцитов (зрелые неиммунные лимфоциты) — в 4 раза и CD95+-лимфоцитов (Fas-лиганд, маркер апоптоза) — в 5 раз сравнительно с показателем при поступлении в клинику (p < 0,05).

Таким образом, у детей с острой ЭБВ-инфекцией на фоне назначенной терапии с включением мультипробиотика в динамике заболевания измененные показатели Т- и В-клеточного иммунитета имели выраженную позитивную динамику, свидетельствующую о ликвидации выраженной воспалительной реакции со стороны всего организма и соответствующую клиническому выздоровлению, отсутствию затяжного инфекционного процесса, отсутствию угрозы перехода в хроническую ЭБВИ.

Остановимся более детально на динамике уровня экспрессии дифференцировочных маркеров ИКК, выступающих предикторами перехода острой ЭБВ-инфекции в хроническую форму, — CD8+-Т-лимфоцитов, естественных киллеров CD16+, CD95+ (Fas-лиганд, маркер апоптоза), В-лимфоцитов CD20+ и CD22+. Уровень экспрессии цитолитических CD8+-Т-лимфоцитов при поступлении в стационар был снижен (0,53 ± 0,03 г/л) по сравнению с показателем у детей из группы сравнения (p < 0,05) (рис. 3А). В динамике заболевания на фоне проведенной терапии их уровень повысился (0,68 ± 0,06 г/л) и достиг значения аналогичного показателя у детей из группы сравнения (p > 0,05) (рис. 3А). Уровень экспрессии СD16+-естественных киллеров у детей с острой ЭБВ-инфекцией при поступлении в стационар был повышен в 3 раза (1,32 ± 0,07 г/л) по сравнению с показателем в группе сравнения (0,45 ± 0,02 г/л) (р < 0,01) (рис. 3Б). На фоне лечения этот показатель снизился в 2 раза (1,02 ± 0,13) (р < 0,05) (рис. 3Б), но еще оставался незначительно повышенным по сравнению с контрольным значением (р < 0,05) (рис. 3). Уровень экспрессии дифференцировочных маркеров В-лимфоцитов при поступлении в стационар был повышен: CD20+ — в 4 раза (2,12 ± 0,30 г/л), CD22+ — в 7 раз (2,38 ± 0,40) по сравнению с показателем у детей из группы сравнения (p < 0,05) (рис. 4А, 4Б).

На фоне проводимой терапии их уровень снизился в 2 раза (1,02 ± 0,13 г/л и 1,02 ± 0,02 г/л) (р < 0,05) (рис. 4А, 4Б), но еще оставался незначительно повышенным по сравнению с показателем в группе сравнения (0,54 ± 0,06 г/л и 0,34 ± 0,04 г/л) (р < 0,05) (рис. 4).

Уровень экспрессии CD95+-Т-лимфоцитов (Fas-лиганд, маркер апоптоза) у больных с острой ЭБВ-инфекцией при поступлении был резко повышен (5,29 ± 0,50 г/л) и превышел аналогичный показатель в группе сравнения (0,54 ± 0,09 г/л) в 10 раз (р < 0,001). В динамике заболевания его уровень снизился в 5 раз (1,0 ± 0,2 г/л) (р < 0,001), но значения показателя группы сравнения еще не достиг (р < 0,05).

Таким образом, включение мультипробиотика в терапию острой ЭБВ–инфекции улучшает эффективность лечения этого заболевания, имеет выраженную клиническую эффективность, способствует клиническому выздоровлению, препятствует формированию затяжного течения заболевания и переходу в хроническую ЭБВ-инфекцию. Мультипробиотик действует на следующие звенья иммунитета: Т- и В-клеточное путем нормализации уровня экспрессии дифференцировочных маркеров основных ИКК, проявляет иммунорегулирующее действие, особенно при активации клеточного иммунного ответа, имеет иммуномодулирующий эффект, который особенно выражен при недостаточности клеточного иммунитета.