Журнал «Здоровье ребенка» 6 (57) 2014

Статья опубликована на с. 45-48

Вступ

Хронічне запалення дихальних шляхів — один із ключових феноменів бронхіальної астми (БА) [9, 10]. Варто визнати, що недостатня ефективність контролюючого лікування БА певною мірою пов’язана з гетерогенністю запального процесу в дихальних шляхах, а саме з наявністю еозинофільного, нейтрофільного та пауцигранулоцитарного характеру запалення дихальних шляхів [1, 5]. Відмічено, що за наявності нейтрофільного характеру запального процесу в бронхах знижується контрольованость БА з ознаками її терапевтичної резистентності [7]. Це вимагає індивідуалізованого підходу до лікування цієї хвороби, зокрема, з урахуванням характеру запалення дихальних шляхів. Дана вимога є тим більше актуальною, оскільки в останні роки відмічена чітка тенденція до підвищення рівня захворюваності на неалергічну БА, в основі якої зазвичай лежить нееозинофільний характер запалення бронхів [4, 6, 8]. У той же час варто визнати, що діагностика різних запальних фенотипів БА у дітей на сьогодні залишається невдосконаленою. Так, після короткочасного оптимізму щодо цього прийшло усвідомлення того факту, що варіант запалення бронхів, який визначається за цитологічним складом мокротиння, нерідко непостійний і має швидше дискретний, аніж безперервний характер [13]. Враховуючи це, можна припустити, що зменшення діагностичних помилок можна досягнути, визначаючи запальний патерн бронхів на основі комплексу особливостей БА, а також генетичної схильності до їх розвитку [2].

Дійсно, БА розглядається як мультифакторне захворювання, при якому реалізація патологічного процесу визначається взаємодією генетичних факторів і чинників середовища. Сьогодні механізм розвитку цього захворювання трактується з молекулярно-генетичної точки зору з урахуванням поліморфізму генів, що впливають на формування та клінічні прояви БА [11]. Формування запального процесу в бронхах певною мірою визначається генетичною компонентою, яка, зокрема, модифікує здатність дихальних шляхів захищати себе від вдихуваних патогенних речовин із навколишнього середовища. Водночас варто визнати, що предикторна роль генетичних факторів у розвитку характеру запалення бронхів залишається недостатньо вивченою.

Мета роботи — вивчити особливості гетерогенного запалення дихальних шляхів у дітей, які страждають від бронхіальної астми, за делеційного поліморфізму генів GSTM1 та GSTT1.

Матеріал і методи

Обстежені 102 хворі шкільного віку, які страждають від БА. З них у 46 дітей (І клінічна група) встановлено еозинофільний характер запалення бронхів (ЕХЗ), у 33 пацієнтів (ІІ клінічна група) — нейтрофільний варіант (НХЗ), а у 23 (ІІІ група) — пауцигранулоцитарний характер запальних змін (ПХЗ) у бронхах. За основними клінічними характеристиками групи були порівнянні. Так, у І групі хлопчиків було 65,3 %, а середній вік пацієнтів становив 11,2 року. У ІІ клінічній групі частка хлопчиків становила 56,7 %, а середній вік представників даної групи сягав 13,1 року (Р > 0,05). Середній вік представників ІІІ групи становив 10,3 року, хлопчиків серед них було 65,2 % (P > 0,05). За ступенем тяжкості захворювання у І групі тяжка форма траплялася у 27 пацієнтів (58,7 %), середньотяжка — у 15 дітей (32,6 %) та легка — у 4 школярів (8,7 %). У представників ІІ групи тяжка астма траплялася у 15 хворих (45,4 %, Р > 0,05), середньотяжка — у 14 дітей (42,4 %, Р > 0,05), а легка — у 4 школярів (12,2 %, Р > 0,05). У ІІІ клінічній групі наведена вище тяжкість БА відповідно визначалася у 12 (52,2 %) пацієнтів, 10 (43,5 %) дітей та 1 (4,3 %) хворого (P > 0,05).

Характер запалення бронхів визначали на підставі цитологічного аналізу індукованого мокротиння, одержаного шляхом інгаляції гіпертонічних (3, 5, 7 %) розчинів натрію хлориду: за наявності в мокротинні 3 % та більше еозинофільних лейкоцитів робили висновок про еозинофільний характер запальних змін дихальних шляхів, а за наявності 59 % та більше нейтрофільних та менше 3 % еозинофільних гранулоцитів встановлювали нейтрофільний запальний варіант [12]. Пауцигранулоцитарний варіант запалення бронхів встановлювали при меншому вмісті цих гранулоцитів, тобто еозинофілів менше 3 %, а нейтрофілів — менше 59 %.

Про активність запального процесу в бронхах робили висновок за вмістом метаболітів монооксиду нітрогену в конденсаті повітря, що видихається (КПВ) (Ємченко Н.Л., 1994), а неспецифічну реактивність бронхів оцінювали за індексом лабільності (ІЛБ) та її компонентами — індексом бронхоспазму (ІБС) у пробі з дозованим фізичним навантаженням (6-хвилинний біг) та індексом бронходилатації (ІБД) при вдиханні сальбутамолу. Шкірну чутливість негайного типу до основних аероалергенів оцінювали за допомогою прик-тестів із використанням стандартних наборів виробництва ТОВ «Імунолог» (м. Вінниця, Україна). Генетичні дослідження проводилися на кафедрі молекулярної генетики та біотехнології Чернівецького національного університету ім. Ю. Федьковича. Загальну геномну ДНК виділяли з периферичної крові, генотипування GSTM1, GSTT1 здійснювали за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), результати якої аналізували методом електрофорезу в 2% агарозному гелі з використанням трис-боратного буфера. Виявлення делецій у цих генах здійснювали методом мультиплексної ПЛР із використанням відповідних специфічних праймерів. Як позитивний контроль використовували ампліфікацію фрагмента гена BRCA1. Гомозиготні форми з делецією обох копій генів GSTM1 та GSTT1 позначали як M1del та Т1del. Відповідно, наявність цих фрагментів на електрофореграмах свідчила про гомо- або гетерозиготність за нормальними копіями генів та позначалась як М1+ та Т1+.

Отримані результати аналізували методами біостатистики. Правильність нульової гіпотези визначалася з урахуванням рівня значимості Pt (за Стьюдентом) і Pt (метод кутового перетворення Фішера). Дослідження проведене з урахуванням основних положень GCP IH та Гельсинської декларації щодо біомедичних досліджень.

Результати та їх обговорення

Розглядаючи БА як багатофакторне захворювання, у розвитку якого відіграють певну роль генетична схильність до атопії та патогенні чинники зовнішнього середовища, ми вивчали окремі показники взаємодії цих факторів. Так, у створених групах порівняння оцінювали масу тіла при народженні, оскільки вона розглядається як ознака генетичної схильності до БА [3]. Відмічено, що серед хворих І клінічної групи випадки маси тіла при народженні понад 3400 г мали місце у 71,0 % випадків, а менше 2500 г — в 11,0 % спостережень. У ІІ клінічній групі наведена маса тіла при народженні визначалася відповідно у 63,0 та 15,0 % спостережень, а у ІІІ групі ці показники відповідно сягали 52,0 та 4,3 %. Природне вигодовування на першому році життя, що багато в чому є визначальним стосовно імунного статусу дитини в подальшому, у представників І клінічної групи мало місце в 63,0 % випадків, ІІ — у 75,0 % та ІІІ групи — у 43,0 % спостережень.

Генеалогічний індекс за атопічними захворюваннями у дітей з ЕХЗ бронхів становив у середньому 0,061, у ІІ групі — 0,07 та у ІІІ групі — 0,08. У представників І клінічної групи успадкування атопічних захворювань за родоводом матері відмічене у 27,3 %, а батька — 21,7 %; у дітей із НХЗ бронхів такий характер успадкування відмічений у 27,3 та 42,4 % відповідно, а у ІІІ групі — відповідно у 17,4 та 17,4 % випадків. Слід відмітити, що діти сформованих груп порівняння знаходилися під різним пресингом чинників, що сприяють сенсибілізації організму. Так, у представників І клінічної групи наявність килимів в оселях траплялась у 19,0 % випадків, домашніх тварин — у 6,0 %, а експозиція тютюнового диму в побуті — у 17,4 % спостережень. У хворих із НХЗ дихальних шляхів вплив наведених потенційно патогенних чинників відзначався відповідно у 18,0; 6,0 та 24,2 % випадків. Наявність килимів в оселях дітей ІІІ клінічної групи відмічена у 26,0 % випадків, тварин — у 17,4 % та експозиція тютюнового диму, коли дитина виступала як пасивний курець, — у 56,5 % спостережень.

За результатами ПЛР встановлено генетичний дефект у структурі гена GSTT1 у 21,7 % дітей I клінічної групи, 21,2 % осіб II групи та 26 % пацієнтів III групи порівняння (Р > 0,05). Попри відсутність вірогідних відмінностей за частотою поширення генотипу GSTТdel відмічено підвищену схильність до атопічних захворювань за наявності генотипу GSTТdel у дітей із ПХЗ. Так, ознаки атопічного дерматиту в дітей із GSTТdel у III клінічній групі відмічались у 83,3 % випадків, у I групі — у 30 % та у II — у 57,1 % спостережень (Р I : II : III < 0,05). При цьому значна шкірна чутливість негайного типу і вищий рівень загального IgE в крові був притаманний хворим з ЕХЗ. Так, чутливість шкіри на побутові алергени у пацієнтів I групи оцінювалась у середньому 3,83 ± 0,16 «+», а вміст у сироватці загального IgE становив 905,8 МО/мл. У дітей II групи це відповідало 2,75 ± 0,95 «+» (Р < 0,05) і 472,7 МО/мл (Р < 0,05). У III групі чутливість шкіри до цих алергенів не перевищувала «+» реакції (Р < 0,05), а вміст загального IgE становив 669,9 МО/мл (Р < 0,05).

У дітей із НХЗ при GSTТdel відмічалась більш виражена лабільність бронхів. Зокрема, середній показник ІБС у I групі становив 7,5 ± 2,2 % тоді як у II клінічній групі він сягав 16,2 ± 4,5 (Р I : II > 0,05) та у III групі дорівнював 2,3 ± 1,6 % (Р = 0,01). Так, ІЛБ на рівні дрібних бронхів у даних хворих становив 27,1 ± 6,5 %, у I групі — 23,5 ± 4,8 % (Р > 0,05), а у дітей із ПХЗ — 14,6 ± 6,2 % (Р = 0,03).

Гомозиготна делеція GSTM1 частіше визначалась у дітей із НХЗ. Так, генотип GSTMdel у I групі траплявся у 32,6 ± 6,9 % дітей, у II групі у 51,5 ± 8,7 % пацієнтів та у III групі порівняння у 21,7 ± 8,6 % хворих (Р I : II : III < 0,05).

Тяжка БА з генотипом GSTMdel визначалась у 66,7 % випадків, при НХЗ — у 47,0 % (Рф < 0,05), а у представників III групи тяжкого перебігу БА не визначали. Показано, що в дітей груп порівняння визначалась дискордантність частоти виявлення тяжкої БА і показників запалення/гіперреактивності бронхів. Так, середній уміст метаболітів NO у КПВ у дітей I групи становив 39,3 мкмоль/мл, у II групі — 48,5 мкмоль/мл та в III групі — 55,6 мкмоль/мл (Р > 0,05). Чутливість бронхів до гістаміну у даних хворих становила відповідно 2,03; 0,7 та 0,33 мг/мл (Р > 0,05).

У табл. 1 наведена частота виявлення комбінацій поліморфізму GSTT1 та GSTM1 у дітей груп порівняння.

Варто відмітити, що подана структура комбінацій поліморфізму генів GSTT1 та GSTM1 у дітей із різним характером запалення дихальних шляхів визначала також частоту проявів інших характеристик захворювання. Так, за наявності генотипу T1+M1del у хворих груп порівняння відмічена тенденція до тяжкого перебігу БА. Зокрема, тяжка БА у I клінічній групі визначалась у 61,5 % випадків, у II групі — у 42,9 % та у III — у 66,7 % спостережень. Окрім цього, за наявності цього генотипу у хворих із ПХЗ бронхів частіше визначались супутні атопічні захворювання. Так, в усіх цих хворих виявлявся алергічний риніт, який у I групі відмічався лише у 15,4 % осіб, а у II групі — у 71,4 % пацієнтів (Р < 0,05). На противагу цьому у вказаних дітей III групи не визначались випадки підвищеної чутливості до трофоалергенів, прояви якої були визначені за даного генотипу у 21,4 % випадків серед хворих I групи та у 15,4 % спостережень у дітей із НХЗ бронхів. При цьому генотипі у дітей із НХЗ визначалась більш виражена бронхомоторна реакція бронхів на інгаляцію сальбутамолу. Так, ІБД у цих пацієнтів становив у середньому 33 %, у I групі — 13,8 % і у III групі порівняння — 13,6 % (Р II, I : III < 0,05).

У дітей із генотипом T1delM1+ тяжкий перебіг БА у I групі визначався у 37,5 % випадків, у II — у 50,0 % та у III групі — у 100 % спостережень (Р III : I, II < 0,05). У хворих за вказаного генотипу та НХЗ частіше визначались супутні атопічні захворювання. Так, ознаки алергічного риніту та атопічного дерматиту проявлялись у них відповідно у 75,0 і 50,0 % випадків, у I групі — у 12,5 і 50 % спостережень (Р < 0,05). У пацієнтів із ПХЗ дихальних шляхів ознаки вказаних захворювань не відмічались. Водночас варто відзначити, що такі показники патологічного процесу при БА, як уміст у крові загального IgE, метаболітів монооксиду нітрогену у КПВ і лабільність бронхів (ІЛБ), при даному генотипі виявилися більш вираженими у хворих із ЕХЗ. У таких дітей вказані критерії захворювання відповідно становили 905,8 МО/мл, 63,1 мкмоль/мл і 26,8 %. У пацієнтів із НХЗ бронхів наведені додаткові діагностичні критерії відповідали 578,6 МО/мл, 44,4 мкмоль/мл і 19,2 %. У дітей із ПХЗ дихальних шляхів вказані лабораторні показники відповідно становили 392,3 МО/мл, 45,8 мкмоль/мл і 13,6 %.

Таким чином, у хворих на БА шкільного віку з гетерогенним характером запалення дихальних шляхів залежно від делеційного поліморфізму генів GSTM1, GSTT1 та їх комбінацій виявлені суттєві розбіжності в таких клінічних проявах, як тяжкість патології, шкірна чутливість негайного типу до небактеріальних алергенів та частота наявності супутніх алергічних захворювань. При цьому такі лабораторно-інструментальні характеристики захворювання, як реактивність бронхів, вміст у сироватці крові загального IgE, а в конденсаті видихуваного повітря — метаболітів монооксиду нітрогену, у групах порівняння суттєво не відрізнялися.

Висновки

1. У хворих на бронхіальну астму гомозиготна делеція гена GSTT1 визначалася в кожної п’ятої дитини незалежно від характеру запалення бронхів. У хворих з еозинофільним субтипом запалення бронхів вказана делеція гена GSTМ1 відмічена у 32,6 % випадків, при нейтрофільному — у 51,1 % та пауцигранулоцитарному — у 21,7 % спостережень.

2. У дітей із генотипом GSTT1del та еозинофільним характером запалення бронхів супутній атопічний дерматит траплявся рідше, ніж у хворих груп порівняння, хоча рівень загального IgE у сироватці крові в них був вищий, ніж у пацієнтів з іншими субтипами запалення. У хворих із генотипом GSTМ1del та пауцигранулоцитарним запаленням бронхів визначалася більш виражена гіперреактивність бронхів до гістаміну в поєднанні з високим рівнем умісту метаболітів монооксиду нітрогена в конденсаті повітря, що видихається.

3. Тяжка форма бронхіальної астми у хворих із генотипом GSTT1del/ GSTМ1 визначалася у всіх дітей за пауцигранулоцитарного запалення бронхів, у кожного другого хворого — за нейтрофільного типу запалення та у 37,5 % випадків — при еозинофільному запаленні дихальних шляхів.