Журнал "Гастроэнтерология" 4 (54) 2014

Статья опубликована на с. 48-54

Вступ

В останні роки дослідниками активно вивчається роль оксиду азоту (NO) в регуляції шлунково-кишкового тракту в нормі та при патології, зокрема при захворюваннях печінки невірусної етіології [6, 10, 12]. Відомо, що NO має потужну вазодилататорну дію і може бути причиною гіпердинамічного кровообігу, отже, розвитку асциту, гепаторенального синдрому та портальної гіпертензії. NO синтезується в ендотелії з L-аргініну; його дія пов’язана з активацією гуанілатциклази. Активність NO-синтаз можна змінювати введенням, наприклад, NG-монометил-L-аргініну, який усуває багато судинорозширюючих ефектів NO [6, 16]. Так, у щурів із портальною гіпертензією він зменшував прояви гіпертонічного кровообігу, при цирозі печінки у цих тварин чуттєвість до супресорної дії інгібіторів NO підвищена; їх введення підвищує тиск у воротній вені [7]. Останнім часом з’явився інтерес до вивчення ензиму — аргінази (АР) у зв’язку з її участю в метаболізмі NO. Маловідомим є той факт, які ж саме зміни .відбуваються між вмістом АР та метаболітами оксиду азоту (NО_х) при надлишку NO, а також при блокуванні його синтезу. Дослідження властивостей АР та зіставлення її із вмістом метаболітів NO мають важливе значення при з’ясуванні біохімічних процесів, які відбуваються в печінці на тлі дисбалансу NO за умов моделювання експериментального гепатиту [4, 5].

Один з найбільш поширених способів моделювання у тварин дистрофії печінки пов’язаний iз введенням чотирихлористого вуглецю (CCl₄). Цей спосіб був використаний нами як основа для відпрацювання моделі експериментального гепатиту в умовах дисбалансу NO. Враховуючи той факт, що при тривалому блокуванні активності всіх видів синтаз за допомогою неспецифічного блокатора нітро-L-аргініну в наших попередніх дослідженнях ми спостерігали порушення кровообігу в печінці, застій крові в малих та великих венах портального тракту, що створювало гіпоксичні умови для функціонування гепатоцитів [8, 13], залишається відкритим питання щодо впливу дисбалансу NO на тлі одноразового введення CCl₄ на формування патологічного процесу в печінці. Ми припускаємо, що цей спосіб моделювання гепатиту може викликати морфологічну деструкцію та функціональні зміни печінки.

Мета роботи — вивчити особливості морфологічних і біохімічних змін печінки та стан фізіологічної активності щурів при моделюванні гепатиту в умовах дисбалансу оксиду азоту.

Робота є фрагментом науково-дослідної роботи ДУ «Інститут гастроентерології НАМН України» «Вивчити функціональні та структурні порушення печінки на стадіях формування портальної гіпертензії у хворих на хронічні дифузні захворювання печінки» (клініко-експериментальне дослідження), номер держреєстрації 0113U001050.

Матеріали та методи

Дослідження проводились на 24 білих лабораторних щурах-самцях масою 180–230 г, яких випадковим чином розділили на контрольну (n = 6) та 4 дослідні групи:

— І (n = 4) — введення ССl₄ один раз на добу протягом 4 днів. Тварин виводили з експерименту через 7 діб після початку експерименту [15];

— ІІ (n = 4) — одноразове введення ССl₄ з виведенням через 7 діб після початку експерименту [17];

— ІІІ (n = 6) — введення внутрішньочеревинно NG-нітро-L-аргініну (L-NNA) виробництва Sigma-Aldrich (США) протягом 5 діб в дозі 40 мг/кг, в останню добу вводили ССl₄. Тварин виводили з експерименту після 7 діб моделювання;

— ІV (n = 4) — введення внутрішньочеревинно 1% розчину натрію нітропрусиду (NaНП) на фізіологічному розчині (Sodium nitroprusside dihydrate) виробництва Sigma-Aldrich (США) в дозі 2,5 мг/кг ваги тіла протягом 5 діб, в останню добу вводили ССl₄. Тварин виводили з експерименту після 7 діб моделювання.

Моделювання гепатиту відтворювали шляхом підшкірного введення 50% розчину ССl₄ на оливковій олії в дозі 0,4 мл на 100 г маси тварини.

Розчини L-NNA та NaНП готували безпосередньо перед експериментом (згідно з рекомендаціями виробника препаратів) і вводили тваринам внутрішньочеревинно.

Евтаназію тварин здійснювали за допомогою введення летальної дози кетаміну гідрохлориду. Дослідження проводили, дотримуючись нормативів Конвенції з біоетики Ради Європи (1997), Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей, загальних етичних принципів експериментів на тваринах, ухвалених Першим національним конгресом України з біоетики (2001), інших міжнародних угод та національного законодавства у цій галузі.

Для якісної та кількісної оцінки впливу моделювання гепатиту на зміну індивідуально-типологічних, психоемоційних особливостей поведінки тварин їх проводили в лабіринті «відкрите поле» та у припіднятому чотирипроменевому лабіринті (за модифікацією А.В. Калуєва) [9]. Тестування у «відкритому полі» здійснювалося за методикою Буреша [2]. Згідно з методикою «відкрите поле» щура поміщали в освітлену камеру і враховували дефекації, уринації, величину рухової та орієнтовно-дослідницької активностi протягом 5 хвилин. Ця методика дозволяє вивчити індивідуально-типологічні особливості поведінки, пов’язані з проблемою індивідуальної стійкості до емоційних стресів. Тварини проходили тестування в лабіринті, «відкритому полі» до початку та після закінчення моделювання хронічного гепатиту. Згідно з літературними даними [9], тварина, яка проходить тестування не більше ніж 5 хвилин, не запам’ятовує оточуюче середовище, і кожне наступне тестування, віддалене більше ніж на добу, викликає аналогічні реакції на новизну, як i при першому проходженні тестування, тобто не розвивається звикання до «відкритого поля».

Гепатит підтверджували морфологічно. Для гістологічних досліджень біоптати печінки фіксували в 10% розчині нейтрального формаліну, зневоднювали в спиртах висхідної концентрації і заливали в парафін. Гістологічні зрізи товщиною 3–5 мкм забарвлювали гематоксиліном і еозином та за Маллорі в модифікації Слінченка і монтували на предметні скельця. На біоптатах оцінювалася мікроскопічна будова органа, наявність та характер дистрофічних змін, інфільтрація клітинами запалення та стан портальних трактів. Для комп’ютерної морфометрії біоптати фотографували і здійснювали вимірювання за допомогою програми ImageJ 1.45S (розроблена в National Institutes of Health, США). Підраховувалася площа дистрофічних змін щодо загальної площі.

В гомогенаті печінки щурів визначали активність АР за В.А. Храмовим [18], вміст NO_х — за В.А. Метельською [11].

Для статистичного аналізу отриманого числового матеріалу використовували дескриптивну статистику: порівняння середніх значень змінних здійснювали за допомогою параметричних методів (t-критерію Ст’юдента) за нормального розподілу даних ознак, що виражені в інтервальній шкалі. Відповідність виду розподілу ознак закону нормального розподілення перевіряли за допомогою методу Шапіро — Уїлка. Відмінності, отримані за методом парних порівнянь, вважали вірогідними при р < 0,05. Усі вихідні дані, отримані при виконанні роботи, з метою оптимізації математичної обробки вводили у базу даних, побудовану за допомогою електронних таблиць Microsoft Excel 2010 [1, 3, 8].

Результати дослідження

Встановлено, що через 7 днів після чотириразового введення ССl₄ в печінці щурів розвивається гострий гепатит, основою якого є переважно поширена жирова дистрофія, яка займає 40–80 % всієї площі біоптату та завжди локалізована навколо портальних трактів з найбільшим ураженням І–ІІ зони ацинусів (рис. 1). Запальна інфільтрація відсутня. Переважна більшість гепатоцитів, не порушених дистрофією, перебуває у стані еозинофільної дегенерації. Локально у І зоні ацинуса вiдзначалося прогресування дистрофії з розвитком балонної дистрофії.

Морфологічні зміни в І групі супроводжувалися підвищенням активності АР в гомогенатах печінки щурів на 50,0 % (р < 0,01) порівняно з групою контролю (рис. 2). Механізм підвищення активності ензиму можна пояснити значною активацією детоксикаційної функції печінки у щурів в умовах розвитку гострого гепатиту.

Вміст метаболітів NО_х був зниженим на 20,0 % (р < 0,01) порівняно з групою контролю (рис. 3).

Зміни активності АР та вмісту NО_х підтверджують те, що NO-синтаза та АР в умовах експерименту активно конкурують за субстрат L-аргінін. АР як конкуруючий за субстрат ензим і метаболіти подальшого перетворення її продуктів здатні істотно впливати на активність NO-синтазної реакції, чим пояснюється знижений рівень метаболітів оксиду азоту. Слід зазначити, що, незважаючи на морфологічну деструкцію тканини печінки, у тварин цієї групи розвивалася системна позитивно-компенсаторна відповідь організму [5, 7].

У тварин І групи спостерігалося зниження відвідування кількості зовнішніх квадратів на 79,4 %, а внутрішніх — на 78,3 % порівняно з контрольною групою (р < 0,001) (рис. 4).

Максимальна рухова активність у тварин цієї групи спостерігалася на 1-шу хвилину тестування з подальшим зниженням та повною відсутністю активності вже на 3-тю хвилину. Така картина рухової активності подібна до контролю, з різницею в тому, що в контрольній групі рухова активність на 3-й хвилині досягає мінімальних значень, проте не зникає (рис. 5).

Через 7 днів після одноразового введення ССl₄ (ІІ група) спостерігалася схожа з І групою морфологічна картина, але у ряді випадків зміни характеризувалися меншою інтенсивністю. В гомогенатах печінки щурів ІІ групи була виявлена лише тенденція до зниження вмісту NО_х на 16,0 %. Одноразове введення CCl₄ не викликало суттєвих змін і в поведінці щурів. Загальна рухова активність у тварин цієї групи майже не відрізнялась від контролю, про що свідчить незначне підвищення кількості відвідування зовнішніх квадратів лише на 11,6 %. За А.В. Калуєвим, аналіз відвідувань внутрішніх квадратів в цій групі свідчив про зміни не в руховій активності, а в емоційному стані. Максимальна рухова активність у тварин II групи спостерігається на 1-шу хвилину тестування з подальшим зниженням та профілем поведінки, аналогічним такому в контрольній групі, з тією відмінністю, що кількісні показники рухової активності на 3-тю — 5-ту хвилину були вищі за контрольні значення.

Розвиток експериментального гепатиту на тлі нестачі оксиду азоту в 100 % випадків характеризувався вираженим розширенням синусоїдів по всій площині біоптату (рис. 6). Руйнування гепатоцитів внаслiдок жирової дистрофії мало більш локальний характер, також привертав увагу нерівномірний розподіл уражених гепатоцитів по площині біоптату. Так, у всіх випадках зустрічалися зони як більшого, так і меншого ураження, у той час як у попередніх групах кожен портальний тракт був порівняно однаковим.

При моделюванні гепатиту на тлі дисбалансу оксиду азоту було виявлено різний механізм змін активності АР та вмісту метаболітів оксиду азоту. Моделювання гепатиту у щурів ІІІ групи на тлі введення блокатора призводило до інгібування активності АР на 22,1 % (р < 0,05) та зниження вмісту NО_х на 21,5 % порівняно з контрольною групою (рис. 2).

Розвиток гострого гепатиту на тлі надлишку оксиду азоту у 75 % тварин супроводжувався менш поширеною, але більш вираженою жировою дистрофією з локальними фокусами некрозу (рис. 6б).

При моделюванні гепатиту на тлі введення донатору NO активність АР мала тенденцію до підвищення на 9,9 % порівняно з групою контролю, та виявлена тенденція до зниження NО_х на 16,1 %, що аналогічно біохімічним показникам в І групі, у якiй модель гепатиту створювали класичним способом.

Тварини групи з одноразовим введення CCl₄ на тлі 5-добового надлишку NO характеризувалися мінімальною руховою активністю порівняно з тваринами як групи контролю, так і інших груп. У щурів IV групи спостерігалося більш суттєве зниження орієнтовно-дослідницької діяльності порівняно з попередньою групою. Так, кількість стійок у тварин цієї групи була меншою на 60,1 % (р < 0,05), а кількість відвідувань нірок — на 18,8 % порівняно з цими показниками в контрольній групі (рис. 7).

У тварин IV групи з гепатитом, отриманим шляхом одноразового введення CCl₄ на тлі 5-добового надлишку NO, спостерігалися найбільш значні порушення в профілі поведінки порівняно з іншими групами, що відображається у значному зниженні загальної рухової активності, яка зникає вже на 2-й хвилині тестування, та суттєвому зниженні орієнтовно-дослідницької діяльності на тлі підвищення рівня емоційного напруження.

Отримані дані свідчать про те, що нами відтворена модель гепатиту шляхом однарозового введення CCl₄ на тлі надлишку NO. Це підтверджувалося характерними для гепатиту морфологічними змінами та компенсаторною відповіддю організму у вигляді підвищення активності аргінази та зменшення вмісту метаболітів оксиду азоту в гомогенаті печінки. Подібні морфологічні та біохімічні зміни спостерігалися в групі тварин з моделюванням гепатиту, що проводили за загальновизнаним методом [15]. Одноразове введення CCl₄ на тлі надлишку NO призводило до порушення як рухової активності, так і орієнтовно-дослідницької діяльності піддослідних тварин. В подальшому цей спосіб може бути використаний для отримання моделі хронізації та прогрессування гепатиту у щурів з метою з’ясування механізмів патогенезу хронічних дифузних захворювань печінки.

Висновки

1. Введення CCl₄ викликає гостре ураження печінки, яке морфологічно виражається пошкодженням гепатоцитів у вигляді великокраплинної жирової дистрофії I і II зони ацинусів, що супроводжувалося активацією детоксикаційної функції печінки та зниженням вмісту метаболітів оксиду азоту.

2. Введення NG-нітро-L-аргініну та одноразове введення CCl₄ викликає компенсаторне розширення синусоїдів і нерівномірний розподіл жирової дистрофії, при цьому відмічаються зони з мінімальним пошкодженням, що обумовлює більш сприятливий прогноз. В гомогенаті печінки щурів було виявлено інгібування активності аргінази, що свідчить про пригнічення детоксикаційної функції печінки.

3. Введення CCl₄ на тлі надлишку оксиду азоту відрізняється більш тяжким перебігом, коли зона ураження гепатоцитів менше, однак балонна дистрофія і точкові некрози гепатоцитів, сфокусовані в І зоні ацинуса, зустрічалися частіше. Морфологічні зміни супроводжувалися підвищенням активності аргінази та зменшенням вмісту метаболітів оксиду азоту в гомогенаті печінки щурів.