Журнал «Актуальная инфектология» 2 (3) 2014

Статья опубликована на с. 42-48

Вступ

Проблема недіабетичних кетоацидозів (НДК) у педіатрії як одного з універсальних метаболічних розладів, що спостерігається при широкому колі патологічних станів у дітей, є досить актуальною [4]. Багато авторів вказують про схильність до розвитку кетоацидозів на тлі соматичних, інфекційних та інших захворювань у дитячому віці [2, 3, 6].

Інфекційні хвороби мають особливе значення у виникненні кетоацидозів, оскільки характерною рисою їх патогенезу є розвиток інтоксикаційного синдрому, що проявляється відмовою від їжі, блюванням, як наслідок, виникає аліментарне голодування, у тому числі й дефіцит вуглеводів, що дає поштовх для утворення кетонових тіл [3, 4].

Метою нашого дослідження було встановлення метаболічних порушень, що виникають у дітей із НДК на тлі інвазивних і секреторних діарей, та можливих генетичних предикторів їх виникнення.

Для досягнення поставленої мети ми досліджували у дітей із НДК на тлі інфекційних діарей рівні сечової кислоти (СК), продуктів окисної модифікації білків (ОМБ) плазми крові, фенотип ацетилування та еритроцитарні маркери.

Матеріали і методи дослідження

У роботі використані матеріали, отримані під час обстеження 350 дітей віком від 1 міс. до 12 років, які лікувались у Хмельницькій інфекційній лікарні з 2002 по 2012 рік, у яких був клінічно виявлений та лабораторно підтверджений діагноз шигельозу і респіраторної вірусної інфекції з наявністю та відсутністю на їх тлі НДК, та 30 практично здорових дітей.

Визначення продуктів ОМБ проводили за оптимізованим методом визначення рівня карбонільних похідних у сироватці крові, запропонованим В.Ю. Масловським та співавт. (2006), принцип якого полягає у взаємодії з 2,4-динітрофенілгідразином (2,4-ДНФГ) фірми Merck (Німеччина). Для визначення рівнів СК у сироватці крові використовували набір реактивів для визначення СК у біологічних рідинах ТОВ НВП «Філіст-Діагностика».

Для оцінки процесів ацетилування в дітей проводили тестування з сульфадимезином. Після прийому сульфадимезину сечу збирали протягом 6 годин. Метаболіти сульфадимезину (вільний та загальний) визначали в сечі за методом Bratton — Marshall (Вавілін В.А. та ін., 1997; Пентюк О.О. та ін., 2001), який базується на діазотуванні препарату (обробка проби нітритом натрію в кислому середовищі й наступному азосполученні з N-(1-нафтил)-етилендіаміном). Частку ацетильованого сульфадимезину визначали за різницею між загальним та вільним сульфадимезином. Осіб з умістом N-ацетилсульфадимезину < 50 % відносять до повільних, при вмісті 50–60 % — до середніх, > 60 % — до швидких ацетиляторів.

Визначення еритроцитарних антигенів крові системи АВО, Rh проводилося за допомогою реакції аглютинації із застосуванням групоспецифічних сироваток виробництва Вінницької станції переливання крові, стандартних тест-еритроцитів, моноклональних антитіл асоціації «Рідан» (м. Київ). Для встановлення фенотипів систем MN та P використовували гіперімунні сироватки анти-M, анти-N, анти-P, виготовлені підприємством із виробництва бактерійних препаратів Санкт-Петербурзького інституту вакцин і сироваток. Визначення фенотипів гаптоглобіну крові (Нр 1-1, Нр 2-1, Нр 2-2) проводили за допомогою електрофорезу в крохмально-агаровому гелі.

Результати досліджень та їх обговорення

Гіперурикемія є інтегральним тестом, що відображає деструктивні процеси в клітинах і може бути як причиною посиленого синтезу уратів (при гіпоксії, фізичному навантаженні, посиленні катаболізму макроергічних сполук, голодуванні, загибелі клітин унаслідок некрозу й апоптозу), так і результатом зниженої екскреції їх із сечею. Експериментально доведено, що причиною гіперкетонемії є надмірний синтез кетонових тіл (КТ), а не порушення їх утилізації тканинами (кетоліз) [4, 6, 8, 10]. Існує також думка, що синтез КТ при вираженій гіпоглікемії може бути частиною біологічної компенсаторної реакції глюконеогенезу, при якій КТ можуть бути попередниками ендогенного синтезу глюкози.

Ми дослідили рівні СК у 93 дітей із НДК на тлі інфекційних діарей — основна група, у 36 дітей без НДК — група порівняння. Також досліджували рівні СК у 30 здорових дітей контрольної групи.

На рис. 1 показано, що рівні СК у здорових дітей становили 138,56 ± 9,57 мкмоль/л, у дітей без НДК — 172,78 ± 11,31 мкмоль/л, у групі дітей із НДК — 357,74 ± 8,69 мкмоль/л, що у 2,6 раза вище (р < 0,001), ніж у здорових дітей, та у 2,1 раза вище, ніж у дітей без НДК (р < 0,001). Рівні СК у здорових дітей і в групі дітей без НДК відрізнялись, але різниця невірогідна.

Отримані дані свідчать, що при розвитку НДК у дітей має місце гіперурикемія, яка свідчить про порушення пуринового обміну, оскільки в усіх дітей основної групи рівні СК були вищими за вікову норму або на її верхній межі. Гіперурикемія є наслідком зниженої екскреції уратів при кетоацидозі, оскільки при розвитку НДК значно зростає рівень ацетоацетату та β-гідроксибутирату в сироватці крові, і це сприяє зниженню екскреції СК у проксимальних канальцях нирок і розвитку гіперурикемії.

Окислювальні механізми відіграють ключову роль у патофізіології розвитку НДК і роблять свій внесок у перебіг захворювання. Надмірна активація реакцій вільнорадикального окислення являє собою типовий патологічний процес, що зустрічається при різних захворюваннях. Нами визначено рівні ОМБ плазми крові в 64 дітей із НДК на тлі інфекційних діарей — основна група, 36 дітей з інфекційними діареями без НДК — група порівняння та у 30 здорових дітей — контрольна група.

На рис. 2 показано вміст карбонільних похідних у здорових та хворих дітей з НДК і без НДК на тлі інфекційних діарей.

У дітей основної групи вміст карбонільних похідних становив 4,53 ± 0,14, у дітей групи порівняння — 3,31 ± 0,29 мг/г білка, у контрольній групі дітей — 2,11 ± 0,34 мг/г білка, тобто в дітей із НДК уміст карбонільних похідних в 1,37 раза був вищим, ніж у дітей без НДК (р < 0,01), та у 2,14 раза, ніж у здорових дітей (р < 0,001), а в деяких дітей його концентрація була вищою більше ніж у 2,5 раза.

Отримані дані свідчать про недостатність антиоксидантної системи організму при розвитку НДК у дітей і значну роль в перебігу захворювання активних форм кисню, що призводить до окисної модифікації молекул білків із наступним порушенням їх функції, деструкції клітинних мембран, оскільки продукти ОМБ є маркерами хімічного апоптозу, який є одним із ранніх проявів запрограмованої смерті клітини, тобто індикатором пошкодження тканин [3, 12].

Розподіл еритроцитарних антигенів крові системи AB0, Rh, MN, P та сироваткових гаптоглобінів у дітей із НДК і без НДК на тлі інфекційних діарей

Клінічна імуногенетика приділяє велику увагу вивченню розподілу генетично детермінованих антигенів при соматичних та інфекційних захворюваннях у дітей. Дані типування дозволяють використовувати їх як маркери ризику виникнення патологічних станів та особливостей їх клінічного перебігу [5, 7, 11].

Для визначення можливостей використання генетично детермінованих антигенів як маркерів ризику виникнення НДК у дітей на тлі інфекційних діарей виконувався порівняльний аналіз їх розподілу серед хворих (Nр = 72) та в популяції (Nс = 52). Антигени систем АВО і Rh-фактора було типовано серед 72 хворих, антигени системи Р і MN — серед 49, Hp — серед 61. У подальшому вивчався й порівнювався розподіл як окремо взятих антигенів, так і їх 2-, 3-, 4- і 5-компонентних асоціативних систем.

У табл. 1. продемонстровано розподіл антигенів систем АВО і Rh-фактора серед хворих дітей із НДК на тлі інфекційних діарей та в дітей без НДК.

Дані табл. 1 свідчать, що серед дітей із НДК спостерігається значна тенденція до накопичення антигенів A(II) (RR = 1,60), B(III) (RR = 1,11), AB(IV) (RR = 4,03) системи АВО, а також накопичення антигена Rh(–) системи Rh-фактора (RR = 2,12). Однак указані особливості розподілу цих антигенів є статистично невірогідними (P > 0,05) і не можуть самостійно використовуватись як маркери ризику виникнення НДК у дітей на тлі інфекційних діарей. Тому ми продовжили вивчення їх розподілу серед більш інформативних багатокомпонентних асоціативних систем перерахованих антигенів.

Разом із тим спостерігається статистично вагома закономірність (P < 0,01) зменшення частоти носіїв антигена 0(I) (RR = 0,33), що може використовуватись як маркер стану відносної резистентності у виникненні НДК у дітей на тлі інфекційних діарей.

Дослідження антигенів системи Р (Р(+)/Р(–)) та гаптоглобіну проводились у 49 хворих дітей основної групи та в 52 дітей групи порівняння. Вірогідної різниці щодо накопичення даних антигенів системи Р та гаптоглобіну в обох групах дітей не виявлено.

У табл. 2 продемонстровано розподіл антигенів системи MN серед 49 хворих на НДК у дітей на тлі інфекційних діарей та у 52 хворих дітей без НДК.

Дані табл. 2 свідчать про статистично суттєве (P < 0,05) накопичення антигена M зі зростанням коефіцієнта узгодження Пірсона до 5,19 в дітей основної групи з НДК.

Отже, антиген M може бути використаний як маркер ризику виникнення НДК у дітей на тлі інфекційних діарей (RR = 2,57), а статистично вагоме (P < 0,05) зменшення частоти носіїв антигена 0(I) (RR = 0,33) може використовуватись як маркер відносної резистентності щодо виникнення НДК у дітей на тлі інфекційних діарей.

Сумарний рівень ризику, що маркується одразу кількома антигенами, є більш точним і інформативним. У зв’язку з цим нами вивчено можливі багатокомпонентні антигенні асоціативні системи названих вище антигенів. У табл. 3 показано накопичення 2-компонентних асоціацій антигенів систем АВО i Rh-фактора в дітей основної групи та групи порівняння.

Дані таблиці свідчать, шо антиген 0(I) у поєднанні з антигеном Rh(+) більш доцільно використовувати як маркер стану відносної резистентності щодо виникнення НДК у дітей на тлі інфекційних діарей у зв’язку подальшим зниженням рівня коефіцієнта відносного ризику до 0,26 (P < 0,01). Особливості накопичення 2-компонентних асоціацій антигенів систем ABO i P серед дітей основної та контрольної груп наведено в табл. 4.

Отримані дані свідчать, що у хворих частота носійства асоціації антигенів 0(І) і Р(+) зменшується до 0,18 порівняно з 0,37 у контрольній групі, тому згадана асоціація, що складається з поєднання антигена — маркера стану відносної резистентності й антигена P(+) з тенденцією до накопичення, може використовуватись як маркер стану відносної резистентності щодо виникнення в дітей НДК на тлі інфекційних діарей із коефіцієнтом відносного ризику 0,39 (P < 0,05).

Носійство асоціацій антигенів AB(ІV)Р(–) та B(ІII) і Р(–) серед дітей основної групи не зустрічається взагалі, тому порівняно з частотою 0,02 та 0,06 відповідно в дітей із груп порівняння дані асоціації можуть вірогідно (P < 0,05) використовуватись як асоціації стану відносної резистентності виникнення в дітей НДК на тлі інфекційних діарей.

Отже, для коректного прогнозування рівня ризику виникнення у дітей НДК на тлі інфекційних діарей не тільки доцільно, а й необхідно вивчати асоціативні багатокомпонентні системи антигенів.

Міжлокусну взаємодію антигенів та її вплив на сумарний рівень ризику виникнення захворювань можна спостерігати на прикладі особливостей розподілу 2-компонентних асоціацій антигенів систем ABO i MN серед дітей основної групи та групи порівняння.

Отримані дані свідчать, що асоціація 0(І)MN може використовуватися як маркер стану відносної резистентності щодо виникнення в дітей НДК на тлі інфекційних діарей з однаковим рівнем коефіцієнта відносного ризику Вульфа (RR = 0,33; P < 0,05).

Проведено дослідження особливостей накопичення 2-компонентних асоціацій антигенів систем ABO i гаптоглобіну. Приблизно рівномірне поширення серед хворих і в популяції всіх трьох класів гаптоглобінів — Hp1–1, Hp2–1 і Hp2–2 при асоціації з антигеном стану відносної резистентності 0(І) вірогідно змінюється (P < 0,01) лише в одному випадку з трьох — для гаптоглобіну Hp2–2 (RR = 0,11; P < 0,01). Коефіцієнт відносного ризику Вульфа зменшився в 3 рази. Отже, асоціація антигенів 0(I)Hp2–2 може слугувати маркером стану відносної резистентності щодо виникнення в дітей НДК на тлі інфекційних діарей із високим рівнем вірогідності (P < 0,01).

Загалом слід відзначити, що рівень коефіцієнта відносного ризику Вульфа для дітей, хворих на НДК на тлі інфекційних діарей, які є носіями антигена 0(І), моделюється носійством антигенів Hp2–2, Rh(+), MN, P(+). Виявлені асоціації антигенів — 0(I)Hp2–2, 0(I)Rh(+), 0(I)MN, 0(I)P(+) — можна статистично вірогідно (Р < 0,05) використовувати як маркери стану відносної резистентності щодо розвитку НДК у дітей на тлі інфекційних діарей із різними рівнями коефіцієнта відносного ризику (RR = 0,11, 0,26, 0,33 і 0,39 відповідно).

Наявність вірогідної відмінності у розподілі окремих еритроцитарних і сироваткових антигенів у хворих дітей із НДК спонукала нас до аналізу багатокомпонентних асоціацій антигенів крові, або гаплотипів. Проведення такого дослідження дає можливість виділити з усіх комбінацій ряд маркерів, що маніфестують схильність або резистентність до виникнення НДК. Всі асоціації були розподілені на 4 групи, які відрізнялися між собою наявністю як ведучого антигена 0(I), А(II), В(III), АВ(IV) системи АВ0.

Найбільш високий критерій відносного ризику виникнення в дітей НДК на тлі інфекційних діарей установлено при розгляді трикомпонентної асоціації, до якої відноситься асоціація антигенів B(III)P(+)N, із рівнем коефіцієнта відносного ризику Вульфа, не меншим за 7,12 (P < 0,01).

Вивчення 4- та 5-компонентних асоціативних систем не виявило маркерів стану відносної ризику щодо виникнення НДК.

Отже, при всіх антигенних асоціаціях, які мали місце в дітей із НДК на тлі інфекційних діарей, показник відносного ризику Вульфа був найбільшим при трикомпонентній асоціації B(III)P(+)N, сягаючи (RR = 7,12). Також виявлені асоціації, які можуть стати маркерами стану відносної резистентності виникнення НДК у дітей, — діти з першою групою крові, позитивним резус-фактором, антигенами Р та МN і сироватковим гаптоглобіном Hp(2–2). Таким чином, отримані дані, безумовно, свідчать про наявність спадкових передумов щодо виникнення НДК на тлі інфекційних діарей.

Фенотип ацетилування в дітей з інфекційними діареями з наявністю та відсутністю у них НДК

Пошуки предикторів захворювань, показників для прогнозування їх перебігу та ефективності фармакотерапії, критеріїв виділення груп ризику, побічних чи парадоксальних дій ліків вимагає дослідження асоціацій між різноманітними біологічними маркерами й генетично детермінованими ферментними системами. Високий рівень генетичної гетерогенності та його індивідуальні фенотипи в людини потребують типування за можливо більшим числом маркерів.

Тісний зв’язок фенотипу ацетилування з генетичним поліморфізмом за N-ацетилтрансферазою дає можливість використовувати його як генетичний маркер.

Зв’язок процесів ацетилування з виникненням НДК у дітей на тлі інфекційних захворювань не досліджувався. Враховуючи частоту виникнення НДК на тлі інфекційної патології в дітей та його негативний вплив на клінічний перебіг хвороби, важливо знати стан процесів ацетилування у дітей із НДК. Потреба в цьому є нагальною, оскільки для лікування інфекційних хвороб можуть застосовуватися препарати — субстрати N-ацетилтрансферази, що пов’язано з ризиком виникнення побічних ефектів.

Обидва ізоферменти NAT-1 і NAT-2 каталізують процеси як N-ацетилування (деактивації), так і О-ацетилування (активації) різних продуктів метаболізму і ксенобіотиків. Також вони беруть участь у регулюванні й переносі субстратів між ацетил-СоА й іншими субстанціями, які беруть участь у процесах ацетилування. Як відомо, ацетил-СоА бере активну участь у синтезі КТ. Тому вивчення фенотипу ацетилування дасть змогу оцінити активність ферментативних систем, які беруть участь у процесах детоксикації та опосередковано беруть участь у синтезі КТ.

Для вирішення поставлених задач нами визначено фенотип ацетилування в 78 дітей, які перебували на стаціонарному лікуванні у Хмельницькій інфекційній лікарні з інфекційними діареями і в яких мав місце НДК. Ці діти становили основну групу. Крім того, нами обстежені 33 дитини з інфекційними діареями, у яких хвороба перебігала без розвитку кетоацидозу, — група порівняння. Діти обох груп не відрізнялися за віком, статтю та тяжкістю захворювання.

Проведені дослідження показали, що популяція обстежених нами дітей основної групи та групи порівняння за результатами тестування чітко розділялася за фенотипом ацетилування сульфадимезину (рис. 3, 4). За вмістом ацетил-сульфадимезину в сечі, зібраній за перші 6 годин, розподіл обстежених мав бімодальний характер.

Як показано на рис. 3, в основній групі дітей метаболіт сульфадимезину в сечі в середньому становив 34,39 ± 1,26 %, у дітей групи порівняння — 54,02 ± 2,11 %.

Установлено, що серед дітей групи порівняння (табл. 5) повільні ацетилятори становили 36,4 %, а в дітей зі швидким та середнім типом ацетилування — 63,6 %. Серед дітей основної групи повільні ацетилятори переважали у 87,3 % випадків, у дітей із середнім і швидким типом ацетилування було 12,8 % (P < 0,05), тобто в дітей із НДК активність ферментів, які беруть участь у процесах деактивації ксенобіотиків і токсикантів, знижена.

Вірогідність даних оцінювалась за допомогою непараметричного методу Манна — Уїтні (критерій U).

Ми не виявили вірогідної залежності між частотою фенотипів швидких і повільних ацетиляторів серед хлопчиків і дівчаток, що свідчить про відсутність залежності фенотипу ацетилування від статі дитини та приналежності до вікової групи.

Отже, серед дітей із НДК вірогідно переважають повільні ацетилянти (P < 0,001), що дозволяє стверджувати: повільний фенотип ацетилування є генетичним предиктором виникнення НДК у дітей. Також одержані дані свідчать, що в дітей із НДК має місце зниження активності ферментів, які беруть участь у метаболізмі ксенобіотиків та інших токсикантів.

Таким чином, на підставі одержаних даних слід вважати, що предикторами виникнення НДК у дітей на тлі інфекційних діарей є повільний фенотип ацетилування і трикомпонентна асоціація B(III)P(+)N.

Висновки

1. Розвиток НДК у дітей супроводжується розвитком гіперурикемії та посилює процеси ОМБ плазми крові.

2. Підвищений уміст СК та продуктів ОМБ у дітей із НДК на тлі інфекційних діарей можуть виступати лабораторним критерієм метаболічних розладів.

3. Отримані дані свідчать про наявність спадкових передумов для розвитку НДК у дітей. Ці передумови асоційовані з генетично детермінованими еритроцитарними антигенами — антиген М системи MN, трикомпонентна асоціація B(III)P(+)N, які можуть бути використані як маркери ризику виникнення НДК у дітей на тлі інфекційних діарей.

4. Маркером ризику виникнення НДК у дітей є також повільний фенотип ацетилування, якій свідчить про зниження у таких дітей активності ферментних систем, що беруть участь у процесах метаболізму ксенобіотиків та інших токсикантів.

Перспективи подальших досліджень у даному напрямку

Ферменти β-окислення НЕЖК локалізовані в середині мітохондрій, але внутрішня мітохондріальна мембрана непроникна для довголанцюжкових ацильних похідних КоА. Тому на внутрішній мітохондріальній мембрані функціонує спеціальна транспортна система, що включає аміноспирт карнітин, який бере участь у перенесенні молекули ацил-КоА до мітохондріального матриксу.

У дітей раннього віку ендогенний синтез карнітину дуже низький, активність його утворення залежить від функціонального стану печінки й нирок, а екскреція значно підвищується при інтеркурентних захворюваннях, особливо при дисфункції ниркових канальців, порушеннях діяльності ШКТ. Усе це зумовлює в дітей раннього віку високий ризик виникнення карнітинової недостатності. Також дефіцит карнітину може виникнути при його споживанні внаслідок підвищеного окислення жирних кислот для забезпечення необхідного рівня АТФ [2, 5, 6]. Вищезазначене є показанням для дослідження рівня карнитину в дітей із наявністю НДК.