Газета «Новости медицины и фармации» 6 (535) 2015

Статья опубликована на с. 30-32 (Укр.)

Актуальність проблеми. Вакцинація — один із ефективних методів профілактики інфекційних хвороб, дієвість якого підтверджена часом. За останні сто років у сфері вакцинації, як і в інших галузях медицини, сталися значні зміни. В імунопрофілактики початку ХХІ ст. такі ж відмінності від імунопрофілактики початку ХХ ст., як і, наприклад, у хірургії, анестезіології, що зазнавали змін в інтервалі 100 років. Зміни в імунопрофілактиці стосувалися розширення спектра захворювань, яким можна запобігти, моніторингу за безпечністю та контролю якості вакцин, а також технологій їх виробництва. Зміни в технологіях виробництва вакцин пов’язані з необхідністю отримання антигенного матеріалу для проведення щеплень, забезпечення вищого рівня безпеки. Лікар має знати особливості складу й основи виробництва вакцин, що дозволить об’єктивно та якісно інформувати пацієнтів перед вакцинацією, відповідати на ряд питань пацієнтів, пов’язаних із фобіями населення щодо вакцинації.

Загальна мета: знати особливості виготовлення сучасних імунобіологічних препаратів для проведення активної імунопрофілактики.

Зміст навчання

Теоретичні питання

1. Технології виготовлення живих вакцин:

а) отримання вакцинальних штамів шляхом проведення серії пасажів;

б) отримання атенуйованих вакцинальних штамів при розмноженні в гетерологічному організмі;

в) конструювання атенуйовних вакцин (інженерна атенуація).

2. Технології виготовлення інактивованих вакцин:

а) створення інактивованих вакцин шляхом інактивації мікроорганізма;

б) субодиничні вакцини, ДНК-вакцини.

3. Технології створення вакцин, що розробляються.

Уже понад 200 років минуло з моменту винаходу вакцинації, і сьогодні ця ефективна методика профілактики захворювань є, без перебільшення, основою людської цивілізації.

Споглядаючи минуле імунопрофілактики, ми повинні констатувати та розуміти, що з науково-технічним прогресом змінювалися й самі вакцини: склад вакцин, технології їх виробництва. Хоча, дійсно, положення вакцинології, закладені трохи більше 100 років тому, і сьогодні залишаються тією ж основою, на якій ґрунтуються принципи вакцинації.

Розробка нових вакцин стартувала на початку XX століття, коли з’явилися методи стабільної атенуації (ослаблення) мікроорганізмів, що виключають ризик розвитку хвороби, і була відкрита можливість використовувати для вакцинації знешкоджені бактеріальні токсини. Підходи в технологіях виготовлення нових вакцин особливо інтенсивно змінювалися в останні десятиліття завдяки значним досягненням у широкому діапазоні взаємопов’язаних наукових дисциплін, у тому числі молекулярної біології, генетики, хімії білків і полісахаридів, імунології, вірусології, бактеріології.

Більшість наявних вакцин були створені для профілактики інфекційних захворювань, а не для терапії. Проте нові технології створення вакцин розширили галузь застосування — від профілактики інфекційних хвороб до профілактики їх наслідків (наприклад, вакцинація проти гепатиту В запобігає розвитку гепатоцелюлярної карциноми як наслідку перебігу хронічного гепатиту В; або ж вакцинація проти ВПЛ-асоційованої патології запобігає розвитку раку шийки матки). Ряд вакцин зараз перебувають на стадіях доліцензійних досліджень, метою їх створення є профілактика та лікування неінфекційних захворювань, таких як автоімунні захворювання, рак, алергія, наркоманія. Наприклад, вчені зі Стенфордського (США) й Лейденського (Нідерланди) університетів розробили ДНК-вакцину BHT-3021. Вакцина створена на основі плазміди, вона кодує попередник інсуліну — проінсулін. Це вакцина зворотної дії: якщо звичайні вакцини повинні активувати імунні реакції, то BHT-3021, навпаки, нейтралізує цитотоксичну дію Т-кілерів, направлену проти острівців Лангерганса. У першій фазі клінічних випробувань BHT-3021 показала свою ефективність у дослідженні, у яке було включено 80 осіб. Половина з них кожних сім днів протягом 12 тижнів отримувала внутрішньом’язові ін’єкції BHT-3021, а друга половина — плацебо. Після закінчення цього терміну група, яка отримувала вакцину, продемонструвала підвищення рівня С-пептидів в крові, що свідчить про відновлення функції бета-клітин. Ніяких серйозних побічних ефектів у жодного з учасників зафіксовано не було.

Для кращого викладення матеріалу щодо технологій виготовлення вакцин варто було б існуючі на сьогодні імунобіологічні препарати для проведення активної імунізації поділити на три основні категорії:

1. «Живі» вакцини. Такі вакцини містять живий ослаблений (атенуйований) мікроорганізм, що при введенні в організм розмножується, не викликаючи захворювання.

2. Інактивовані або субодиничні вакцини містять вбиті (інактивовані) мікроорганізми або їх окремі компоненти. Саме останні й відносять до субодиничних вакцин. При введенні інактивованих або субодиничних вакцин в організм реплікації мікроорганізмів не відбувається.

3. Вакцина на основі нуклеїнових кислот (зазвичай ДНК-вакцини). При цьому відбувається відтворення вакцинального антигену самим організмом щепленої особи.

Технологія створення живих вакцин

Мікроорганізми, що входять до складу живих вакцин, при введенні в організм розмножуються та індукують формування імунної відповіді подібно до імунної відповіді, яка формується при природній інфекції. Мікроорганізми для таких вакцин отримують шляхом атенуації (ослаблення). На сьогодні існує декілька методів атенуації мікроорганізмів для створення таких вакцин.

Отримання живих атенуйованих штамів мікроорганізмів шляхом проведення серії пасажів

Це класична методика атенуації вірусів та бактерій для отримання живих вакцин. Атенуація бактерій вперше була проведена в середині 1880-х років. Луї Пастер зумів досягти формування захисту від сибірки через введення в організм тварин хімічно атенуйованих бактерій. На початку ХХ ст. було отримано культуру M.bovis, що є основою вакцини для профілактики туберкульозу. Для цього було проведено 230 пасажів M.bovis протягом 13 років. У 30-х роках таким чином було отримано вакцинальний штам вірусу жовтої гарячки, атенуація якого була досягнута шляхом проведення 200 пасажів у курячому яйці. Пізніше Альберт Сабін розробив прототип сучасної вакцини для профілактики поліомієліту, культивуючи вірус серією пасажів у культурі клітин мавп, та продемонстрував формування захисту при пероральному її введенні в організм. Подібним чином протягом 60–70-х років були отримані вакцинальні штами вірусів кору, епідемічного паротиту, краснухи та вітряної віспи. Один з останніх вакцинальних штамів був отриманий для профілактики ротавірусної інфекції. Вакцинальний штам було отримано з ротавірусу, що циркулював наприкінці 80-х рр. у Цинциннаті (США). Було проведено 26 пасажів виділеного ротавірусу в культурі клітин нирок африканської зеленої мавпи, перш ніж було отримано вакцинальний штам для першої зареєстрованої вакцини для профілактики ротавірусної інфекції.

Атенуація шляхом отримання вакцинальних штамів при розмноженні в гетерологічному організмі

Цей метод походить з часів Едварда Дженера, який використав вірус коров’ячої віспи для щеплення людині. На сьогодні для отримання вакцини для профілактики натуральної віспи використовують гібридний вірус — суміш вірусу натуральної віспи та вірусу коров’ячої віспи, що не зустрічається в природі. Е. Дженер увів у медичну практику використання для щеплення людей мікроорганізмів, патогенних для тварин, із метою створення імунітету проти інфекцій у людей. На сьогодні не лише використовують гетерологічно патогенні віруси, а й проводять їх атенуацію для послаблення патогенних властивостей. Наприклад, п’ятивалентна вакцина для профілактики ротавірусної інфекції отримана з коров’ячого штаму ротавірусу (WC3), що може реплікуватися в організмі людини, не викликаючи симптоматичних проявів інфекції. Але для забезпечення надійного захисту від захворювання в людини використання ротавірусу WC3 є недостатнім. Посилення захисту досягається шляхом реасортації — сумісного культивування коров’ячого ротавірусу та ротавірусу, патогенного для людини. У результаті реасортації коров’ячий вірус отримує здатність до вироблення та експресії G- та Р-протеїнів людського патогенного ротавірусу. Дані білки є протективними, до них формується імунна відповідь, що забезпечує захист від захворювання.

Інженерна атенуація в конструюванні атенуйованих вакцин

Така атенуація досягається шляхом дії на патогенний штам мікроорганізму різних зовнішніх факторів, що здатні викликати мутації (наприклад, дія низьких температур при реплікації збудника або ж множинні пасажі in vitro), з подальшою селекцією атенуйованого штаму. Таким чином була отримана оральна вакцина для профілактики черевного тифу. Іншим прикладом є жива вакцина для профілактики грипу: для отримання вакцинального штаму вірусу грипу пасаж патогенного вірусу в клітинах курячого ембріону відбувається при низькій температурі (порівняно з температурою тіла людини) — +25 °С. У результаті отриманий таким шляхом вакцинальний вірус погано реплікується при температурі тіла людини. Введення такого вірусу інтраназально призводить до його реплікації в клітинах епітелію, що вистилає носові ходи, та формуванню імунітету до захворювання. При цьому вірус не здатний реплікуватися в нижніх дихальних шляхах та спричинювати симптоми та ускладнення, притаманні грипу.

Технологія створення інактивованих вакцин

Інактивовані вакцини можуть містити цільний інактивований мікроорганізм або його окремі компоненти, що були отримані хімічним, фізичним чи молекулярним шляхом.

Вакцини, що містять цільний мікроорганізм

Першість у створені таких вакцин належить Луї Пастеру, який наприкінці 1800-х рр. використав для щеплення тварин, а згодом і людини інактивований шляхом висушування вірус сказу, що був виділений зі спинного мозку кроля. Джонас Солк створив прототип сучасної цільновіріонної інактивованої вакцини для профілактики поліомієліту, культивуючи вірус у клітинній культурі, провівши його інактивацію формальдегідом та продемонструвавши, що внутрішньом’язове введення інактивованого поліовірусу забезпечує формування імунітету та захист від хвороби. За подібним принципом були отримані вакцинальні віруси та створені вакцини для профілактики гепатиту А, японського енцефаліту та сказу. Варто зазначити, що інактивація мікроорганізмів можлива як хімічними речовинами (наприклад, формалін, формальдегід), так і за рахунок фізичних факторів — дія високих температур.

Сучасним прототипом інактивованої вакцини для профілактики кашлюка є цільноклітинна (целюлярна) вакцина, що являє собою інактивований збудник захворювання Bordetella pertussis. Ця вакцина ефективна та безпечна, але вона є реактогенною, тому її все менше використовують для щеплення в дітей.

Субодиничні вакцини

Створювати вакцини проти нових інфекцій, використовуючи старі випробувані технології, вдається не завжди. Деякі мікроорганізми, наприклад вірус гепатиту B, практично неможливо виростити в культурі клітин, щоб отримати інактивовану вакцину. У багатьох випадках вакцини на основі вбитих мікроорганізмів виявляються неефективними, а живі вакцини — надто небезпечними.

Субодиничні вакцини містять один або більше антигенів мікроорганізмів, отриманих різними шляхами, що при введенні в організм призводять до формування імунітету. Хоча відповідно до прийнятої класифікації імунобіологічних препаратів для проведення активної імунопрофілактики анатоксини — це окрема група імунобіологічних препаратів, що відрізняються від вакцин, однак анатоксин за своїм складом є класичною субодиничною вакциною, оскільки містить у своєму складі лише один антиген. Анатоксин — інактивований токсин, що продукується бактерією. Інактивація токсину відбувається хімічним шляхом (наприклад, інактивація формальдегідом або глютаральдегідом). На сьогодні анатоксини використовуються для профілактики дифтерії та правця. Раніше для профілактики гепатиту В використовувалася субодинична вакцина, що являла собою очищений HBsAg, отриманий із крові інфікованих осіб. Незважаючи на те, що вакцина походила «з крові» та теоретично існували ризики щодо інфікування парентеральними інфекціями, ряд кроків у процесі виготовлення даної вакцини призводив до інактивації інфекційних агентів, у тому числі й самого вірусу гепатиту В. Надалі ця вакцина була замінена рекомбінантною субодиничною вакциною, вакцинальний HBsAg якої був синтезований дріжджовою клітиною.

До субодиничних вакцин належать і сучасні вакцини для профілактики кашлюка — вакцини з ацелюлярним (безклітинним) кашлюковим компонентом. Дані вакцини містять лише кілька антигенів збудника кашлюка (інактивований кашлюковий токсин, філаментозний гемаглютинін, пертактин, антиген мікрофімбрій), що дозволяє при низькій реактогенності забезпечувати формування імунітету.

Сучасні вакцини для профілактики інфекції, зумовленої Str.pneumoniae, H.influenzae, N.meningitidis та S.typhi, є полісахаридним антигеном, виділеним із капсули цих мікроорганізмів. Але вакцини, що містять як імунізуючий агент полісахаридний антиген, індукують Т-незалежну нетривалу імунну відповідь у дітей перших років життя. Для вирішення цієї проблеми використовують кон’югацію — об’єднання полісахаридного антигену з білком-носієм, що сприяє формуванню клітин пам’яті навіть у дітей перших місяців життя. Такі вакцини прийнято називати кон’югованими.

Отримання субодиничних вакцин у сучасному світі також можливе через використання ДНК-рекомбінантних технологій. Прототипом такої вакцини, створеним у 80-х рр. за допомогою ДНК-рекомбінантних технологій, є сучасна вакцина для профілактики гепатиту В.

Великі надії покладалися на вакцини, отримані на основі рекомбінантних технологій. Але зараз стало очевидним, що багато створених експериментальних рекомбінантних вакцин викликають слабку імунну відповідь. Імовірно, причина в тому, що в таких препаратах міститься «голий» білок і відсутні інші молекулярні структури, часто необхідні для запуску імунної відповіді. Щоб рекомбінантні вакцини увійшли в практику, потрібні речовини-підсилювачі (ад’юванти), що стимулюють антигенну активність.

Клітинний, особливо цитотоксичний, імунітет ефективно стимулюється при експресії антигену клітинами самого організму, що й відбувається при вірусній інфекції. Вакцини, що містять живі мікроорганізми, як і генні препарати, засновані на ДНК-плазмідах і рекомбінантних вірусних векторах, здатні викликати подібну реакцію імунної системи. Такі препарати, як VLP-вакцини (VLP — virus-like particle — вірусоподібні частки), також здатні активізувати цитотоксичні лімфоцити через представлення антигенів антигенпрезентуючими клітинами, проте цей механізм ініціації імунної відповіді відрізняється від процесу запуску імунної відповіді живими вірусними вакцинами. Однією з привабливих якостей генних вакцин є те, що вони поєднують у собі простоту й здатність викликати імунну відповідь, характерні для рекомбінантних вакцин, і можливість індукції цитотоксичної відповіді, що відбувається при введенні в організм живих мікроорганізмів. Завдяки цим якостям генні вакцини проти інфекційних і онкологічних захворювань дають великі надії при проведенні доклінічних і клінічних випробувань.

Імунізуючий компонент вакцини проти гепатиту В — HbsAg синтезується в дріжджових клітинах у кількості, достатній для промислового виготовлення вакцини. Антиген, виділений зі зруйнованих дріжджів, очищають швидкісним центрифугуванням у поєднанні з імунною хроматографією. Порівняльний аналіз фізико-хімічних, морфологічних і імуногенних властивостей HBsAg, отриманого генно-інженерним способом і виділеного з плазми крові інфікованих вірусом гепатиту В, продемонстрував близькість їх характеристик. Однак поверхневий антиген вірусу гепатиту В (HBsAg), що продукується дріжджами, виявився неглікозильованим. З метою посилення імуногенності в рекомбінантні вакцини були включені, крім HBsAg, білки, що кодуються зонами пpe-S ДНК вірусу гепатиту В. Після етапу очищення глікозильований HBsAg включається до складу вакцини.

Завдяки ДН К-рекомбінантним технологіям були створені вакцини, що містять вірусоподібні частинки. VLP утворюються в результаті самозбирання капсидних білків вірусів при їх внесенні в клітинну культуру. Вакцини на основі VLP мають ряд переваг порівняно з вакцинами інших типів. По-перше, вони складаються з частинок, що містять багато однакових копій антигенів, у структуру яких входять епітопи, що взаємодіють з антитілами. Це забезпечує ефективну активацію як гуморальної, так і клітинної імунної відповіді, у тому числі формування специфічних цитотоксичних лімфоцитів. По-друге, вірусоподібні частки не містять вірусних нуклеїнових кислот і не здатні до самовідтворення, що забезпечує їх безпечність. По-третє, VLP-вакцини ефективні при нанесенні на слизові оболонки, у тому числі ротової порожнини. І, нарешті, існує багато варіантів синтезу таких частинок. Для цього можна використовувати культури клітин ссавців, комах, рослин, а також дріжджі й бактерії. Це забезпечує можливість підбору умов виробництва відповідно до специфічних вимог, що пред’являються до кожного конкретного продукту.

На початку ХХІ ст. з використанням ДНК-рекомбінантних технологій була створена вакцина для профілактики папіломаасоційованої патології. У даному випадку ген, що кодує поверхневий L-1 протеїн вірусів папіломи людини (ВПЛ), був введений до дріжджової клітини для отримання однієї вакцини (квадривалентна вакцина), в іншому випадку відбувалося введення аналогічного гену в клітину з використанням бакуловірусу (бівалентна вакцина). Валентність у даному випадку визначає кількість серотипів ВПЛ, щодо яких при вакцинації буде сформовано імунітет. Так, для створення бівалентної вакцини використовують L-1 протеїн, специфічний для двох серотипів ВПЛ (16-го та 18-го серотипів), для створення квадривалентної — від чотирьох серотипів ВПЛ (16, 18, 6 та 11-го серотипів). Згаданий вище бакуловірус використовується як вектор, тобто «перевізник», що доставляє, переносить ген у клітину. Бакуловіруси (лат. Baculoviridae) — сімейство паличкоподібних вірусів, що є збудниками вірусних захворювань у комах, але при цьому є непатогенними та безпечними для людини та теплокровних тварин.

Перспективні технології створення вакцин

«Зворотна» вакцинологія. Термін «зворотна» чітко окреслює сутність нового технологічного прийому у створенні вакцин. Якщо раніше при створенні вакцин вчені йшли по низхідній лінії, від цілого мікроорганізму до його складових, то тепер пропонується протилежний шлях: від генома до його продуктів. Такий підхід заснований на тому, що більшість захисних антигенів — білкові молекули. Володіючи повними знаннями про всі білкові компоненти будь-якого збудника захворювання, можна визначити, які з них придатні як потенційні кандидаті на включення до складу вакцини, а які — ні.

Піонером «зворотної» вакцинолоії прийнято вважати Rino Rappuoli. Саме R. Rappuoli вперше застосував у 2000 році принцип «зворотної» вакцинології для отримання вакцини для профілактики менінгококової інфекції, зумовленої менінгококом групи B. У 2013 році Європейським медичним агентством (ЕМА) була видана ліцензія на вакцину Baxsero^® для вакцинації проти менінгококової інфекції, зумовленої серотипом В. За цією методикою розробляється й вакцина для профілактики малярії, зумовленої Plasmodium falciparum, що зараз проходить клінічні передліцензійні дослідження.

Генетична імунізація. За останні 10 років сформувався новий напрямок — генетична імунізація. Його називають також ДНК-вакцинацією, оскільки в організм вводять не білок-антиген, а нуклеїнову кислоту (ДНК або РНК), у якій закодована інформація про білок — протективний антиген. Ідея використовувати фрагменти ДНК для вакцинації з’явилася в 50–60-ті роки. Після серії дослідів було з’ясовано, що генетична інформація ДНК зберігає здатність транскрибуватись і транслюватись після перенесення в іншу клітину. Тоді ж виявили, що введення тваринам генома вірусу поліомієліту стимулює вироблення антитіл. Пізніше продемонстрували, що молекули ДНК, отримані з неінфекційних агентів, здатні активувати гуморальний імунітет. Реальна ж можливість використовувати цю технологію в медицині та ветеринарії з’явилася в середині 90-х років ХХ ст. Новий підхід досить простий, дешевий і, найголовніше, універсальний. Зараз вже розроблені відносно безпечні системи, що забезпечують ефективну доставку нуклеїнових кислот у тканини. Потрібний ген вставляють у плазміду (кільце з ДНК) або безпечний вірус. Такий носій-вектор проникає в клітину й синтезує потрібні білки. Трансформована клітина перетворюється на фабрику з виробництва вакцини прямо усередині організму. Вакцинна «фабрика» здатна працювати тривалий період — до року. ДНК-вакцинація викликає повноцінну імунну відповідь і забезпечує високий рівень захисту від вірусної інфекції.

Уже розроблені й випробовуються ДНК-вакцини для профілактики гепатитів B і C, грипу, лімфоцитарного хоріоменінгіту, сказу, імунодефіциту людини (ВІЛ), японського енцефаліту, а також сальмонельозу, туберкульозу й деяких паразитарних захворювань (лейшманіоз, малярія). Ці інфекції вкрай небезпечні для людства, а спроби створити проти них надійні вакцинні препарати класичними методами виявилися безуспішними.

ДНК-вакцинація — один із найперспективніших напрямків у боротьбі з раком. У пухлину можна вводити різні гени: ті, що кодують ракові антигени, гени цитокінів та імуномодуляторів, гени знищення клітини. Усі ці гени можна використовувати одночасно, організовуючи масовану атаку зброєю різних видів.

У 2005 році перша ДНК-вакцина отримала дозвіл FDA (англ. Food and Drug Administration) для застосування на тваринах. Станом на 2013 р. більше ста ДНК-вакцин проходять клінічні випробовування і чотири ДНК-вакцини є ліцензованими для використання у тваринництві.

Однак перш ніж ДНК-вакцинація увійде в медичну практику, слід переконатися в безпеці таких препаратів, вивчити тривалість індукованого ними імунітету й наслідки для імунної системи.

Нанотехнології при створенні вакцин. У травні 2012 року американська компанія Selecta Biosciences представила першу вакцину, створену за унікальною технологією синтетичних вакцинних часток (Synthetic Vaccine Particle — SVP). Суть технології полягає в складанні наночасток, здатних імітувати різні антигени і викликати тим самим імунну відповідь організму. Завдяки процесу складання наночастки, що повністю настроюється, можна активувати імунну реакцію на широкий спектр відповідних антигенів, у тому числі на малі молекули, пептиди, олігосахариди, білки.

Пройти тестовое задание к симпозиуму