Статья опубликована на с. 47-50
Вступ
Одним із актуальних питань сучасного медичного матеріалознавства є пошук і розробка нових імплантаційних матеріалів для розширення арсеналу лікувальних засобів при усуненні посттравматичних кісткових дефектів та деформацій. Проведення хірургічних утручань часто вимагає застосування штучних матеріалів як фіксаторів кісткових фрагментів, опор для утримання форми чи каркасу при заміщенні кісткового дефекту тощо.
Потенційно перспективний вид біоморфної кераміки для усунення посттравматичних дефектів та деформацій, створений відповідно до принципів біоміметики, розроблено в Інституті фізики напівпровідників імені В.Є. Лашкарьова НАН України шляхом просочування кремнієм канальних вуглецевих матриць, що отримують внаслідок піролізу (обвуглювання) різних сортів деревини. Використання вуглецевої матриці біологічного об’єкту дозволяє отримати матеріал, псевдоморфний цьому об’єкту, який має аналогічну біологічному зразку структуру на мікро-, мезо- та макрорівнях. Такі природні ієрархічні пористі структури мають високий рівень складності, який недоступний при інших сучасних технологіях їх виготовлення [2, 7].
Першочерговим завданням дослідження біосумісності будь-якого матеріалу є вивчення ступеня його токсичності щодо живих клітин організму. Відсутність руйнуючої дії на клітини та токсичного впливу на макроорганізм є однією з головних вимог до матеріалів, що планують використовувати для виготовлення імплантатів різного призначення. Важливою ознакою біологічної сумісності імплантаційного матеріалу слід вважати здатність живих клітин розмножуватись та функціонувати в його присутності, оскільки дана властивість живих клітин залежить від впливу оточуючого середовища.
Однією з ефективних моделей дослідження цитотоксичності та біосумісності імплантаційного матеріалу, наближеною до умов in vivo, є методика клонування колонієутворюючих одиниць фібробластів (КУОф). Даний метод дозволяє вивчити взаємодію імплантаційних матеріалів та остеогенних клітин-попередників кісткового мозку in vitro, їх вплив на перебіг клітинної проліферації та диференціації, зробити висновок про наявність чи відсутність цитотоксичного впливу досліджуваного матеріалу на клітини [4].
Мета дослідження. У даній роботі ми ставили за мету дослідити вплив нового імплантаційного матеріалу, біоморфної кераміки на основі карбіду кремнію (біо-SiC), на диференціацію та проліферацію культури клітин стромальних фібробластів, на основі чого оцінити ступінь її цитотоксичності.
Об’єкт і методи дослідження
Для досягнення поставленої мети нами використано методику клонування in vitro за А.Я. Фріденштейном (1973) [3, 5] у модифікації В.С. Астахової (1982) [1].
Забір спонгіози для дослідження проводився з крила клубової кістки пацієнтів ортопедичного профілю поза вогнищем запалення чи дегенеративно-дистрофічних процесів кісткової тканини згідно з Гельсінською декларацією. Клітини кісткового мозку зі спонгіозної кістки вимивали в середовищі 199 на магнітній мішалці, потім за допомогою камери Горяєва проводили підрахунок вимитих ядровмісних клітин з об’єму зразка спонгіози, що вивчався. Об’єм останнього визначався за об’ємом рідини, що була витіснена. Підсадку кістковомозкових клітин проводили в чашках Петрі (діаметр дна 10 см) з розрахунку 5 × 103 на 1 см2 дна чашки. Як фідер використовували летально опромінені (50–60 Гр) клітини кісткового мозку кроля. У чашку додавали культуральне середовище 199 з 20% вмістом сироватки крові людини. У дослідні чашки поміщали зразки ксеногенного гідроксіапатиту (ксеноГАП), синтетичний гідроксіапатит (синтГАП) та біо-SiC.
Чашки Петрі розміщували в ексикатори с газовою сумішшю з 5% вмістом СО2 в атмосферному повітрі та культивували в термостаті при температурі 37 °С протягом 14 діб без зміни культурального середовища. Після закінчення строків культивування (14 діб) культури фіксували 96% етанолом та забарвлювали за Романовським — Гімзе. Підрахунок колоній в чашках проводили за допомогою мікроскопа Olympus. За колонію вважали накопичення 50 та більше стромальних фібробластів кісткового мозку.
Результати оцінювали за показником ефективності клонування стромальних фібробластів кісткового мозку на 105 ядровмісних клітин кісткового мозку — співвідношення кількості колоній, що виросли, до числа підсаджених у чашку Петрі клітин. За колонію вважали накопичення клітин, не менше ніж 50 фібробластів. Ефективність клонування (ЕКУОф) стромальних стовбурових клітин кісткового мозку оцінювали за формулою: ЕКУОф = N/M, де N — кількість колоній, що виросли, помножена на 105, M — кількість підсаджених клітин.
Контролем слугували культури цих же клітин, що були вирощені при аналогічних умовах без внесення в чашку Петрі жодних матеріалів. Окремо підраховували кількість багатошарових колоній серед усіх, що виросли в чашці. Вивчення впливу біо-SiC на культуру стромальних фібробластів проводилося в порівнянні з контролем і гідроксіапатитами синтетичного та ксеногенного походження.
Вибір матеріалів на основі ГАП різного походження пов’язаний з їх широким використанням для заміщення дефектів кісткової тканини та проведення остеопластики в травматології. Даний вибір також був обґрунтований експериментально та клінічно доведеною біосумісністю та відсутністю цитотоксичності зазначеного виду імплантаційних матеріалів. В експерименті досліджено зразки матеріалів відомих виробників, що пройшли фармакологічну реєстрацію, дозволені для використання та широко застосовуються в клінічній практиці.
Оскільки при проведенні експерименту забір клітин-попередників кісткового мозку проводився в одного пацієнта з метою забезпечення однакових умов для їх клонування, кількість матеріалу для дослідження була обмеженою. Тому для статистичної обробки нами обрано параметричний критерій Манна — Уїтні, який може бути використаний при малих вибірках (n ≥ 3) при р = 0,9–0,95.
Результати досліджень і їх обговорення
У результаті проведеного дослідження виявлено ріст та розмноження остеогенних клітин-попередників кісткового мозку людини в усіх серіях експерименту з формуванням колоній. У присутності досліджуваної біоморфної кераміки виявлено ріст як одношарових (рис. 1), так і багатошарових колоній (рис. 2), причому середній приріст колоній становив 43,0 ± 8,5 %. Виявлено, що ефективність клонування при додаванні в культуру клітин біо-SiC становила 22,6 ± 5,9 КУОф серед 105 ядровмісних клітин, що дозволяє оцінити рівень проліферації та диференціації клітин у культурі як високий.
Даний показник характеризує потенціал диференціації культури клітин у присутності даного імплантаційного матеріалу. Відповідно, здатність клітин розмножуватися та диференціюватися з утворенням колоній в присутності біо-SiC свідчить про відсутність негативного впливу на культуру стромальних фібробластів та цитотоксичності досліджуваного матеріалу.
При порівнянні отриманих даних у різних серіях дослідження між собою було виявлено, що серед усіх вивчених зразків матеріалів найвищі результати взаємодії з культурою клітин виявив ксеноГАП, причому результати були кращими, ніж у контролі (табл. 1). На другому місті опинився біо-SiC, на третьому — синтГАП. Результати їх виявились нижчими, ніж у конт–рольній групі (рис. 3).
Разом із тим статистично вірогідної різниці в проаналізованих показниках не виявлено; це дозволяє стверджувати, що всі досліджувані зразки виявили відсутність цитотоксичності щодо культури клітин, а також не вплинули негативно на структуроутворюючий потенціал остеогенних клітин-попередників.
Але, незважаючи на відсутність статистично вірогідної різниці в результатах досліджень, фактичні рівномірні й послідовні їх відмінності дозволяють висловити припущення, що з підвищенням рівня мікроструктурної подібності імплантаційного матеріалу кістковій тканини зростає його позитивний вплив на проліферацію, диференціацію та структуроутворюючий потенціал КУОф.
Висновки
На основі проведеного дослідження встановлено, що остеогенні стромальні клітини-попередники кісткового мозку людини в культурі тканин при взаємодії з біоморфною керамікою на основі карбіду кремнію виявили здатність до проліферації та диференціації з формуванням колоній, причому приріст багатошарових у середньому становив 43 ± 8,5 %, що свідчить про відсутність цитотоксичності досліджуваного матеріалу. Ефективність клонування КУОф у присутності біо-SiC становила 22,6 ± 5,9, що свідчить про відсутність негативного впливу досліджуваного матеріалу на структуроутворюючий потенціал стромальних фібробластів.
Це дає нам можливість зробити висновок, що біо-SiC є біосумісним матеріалом і закладає підґрунтя для проведення подальших експериментальних досліджень взаємодії біоморфної кераміки на основі карбіду кремнію.
Список литературы
1. Астахова В.С. Остеогенные клетки-предшественники костного мозга человека. — К.: Феникс, 2000. — 176 с.
2. Беляев А.Е. Карбид кремния: технология, свойства, применение / Под ред. Р.В. Конакова— Х.: ИСМА, 2010. — 532 с.
3. Фриденштейн А.Я., Петракова К.В., Куралесова А.Н. и др. Клетки-предшественники для остегенной и кроветворной тканей. Анализ гетеротопных трансплантатов костного мозга // Цитология. — 1968. — № 5. — С. 557-567.
4. Малишкіна С.В., Дєдух Н.В. Медико-біологічні дослідження штучних біоматеріалів для ортопедії та травматології // Ортопедия, травматология и протезирование. — 2010. — № 2. — С. 93-100.
5. Фриденштейн А.Я., Лалыкина К.С. Индукция костной ткани и остеогенные клетки-предшественники.— М.: Медицина, 1973. — 223 с.
6. Cordonnier T., Sohier J., Rosset P., Layrolle P. Biomimetic materials for bone tissue engineering-state of the art and future trends // Adv. Eng. Mater. — 2011. — № 13. — P. 135-150.
7. Yukhymchuk V.O., Kiselov V.S., Belyaev A.E. et al. Synthesis, morphological and structural properties of bio-SiC ceramics // Functional materials. — 2010. — Vol. 17, № 4. — P. 520-527.
/48.jpg)
/49-1.jpg)
/49-2.jpg)