Інформація призначена тільки для фахівців сфери охорони здоров'я, осіб,
які мають вищу або середню спеціальну медичну освіту.

Підтвердіть, що Ви є фахівцем у сфері охорони здоров'я.

Мобильная версия

Регистрация Забыли пароль?

Журнал «Травма» Том 17, №4, 2016

Вернуться к номеру

Ефективність клонування стовбурових стромальних клітин кісткового мозку людини в присутності гідроксіапатитної кераміки, отриманої методом мікрохвильового та традиційного спікання

Ефективність клонування стовбурових стромальних клітин кісткового мозку людини в присутності гідроксіапатитної кераміки, отриманої методом мікрохвильового та традиційного спікання

Авторы: Товстоног Г.Б.(1), Панченко Л.М.(2), Сич О.Є.(1) - (1) Інститут проблем матеріалознавства ім. І.М. Францевича НАН України, м. Київ, Україна; (2) ДУ «Інститут травматології та ортопедії НАМН України», м. Київ, Україна

Рубрики: Травматология и ортопедия

Разделы: Клинические исследования

Версия для печати


Резюме

Проведено порівняльне дослідження ефективності клонування стовбурових стромальних клітин кісткового мозку людини в присутності зразків кераміки на основі біогенного гідроксіапатиту, які отримані методами традиційного та мікрохвильового спікання. Для оцінки ефективності клонування було використано метод клонування остеогенних клітин-попередників кісткового мозку за О.Я. Фріденштейном у модифікації В.С. Астахової. Установлене суттєве підвищення показників остеогенної активності стовбурових стромальних клітин кісткового мозку клубової кістки людини в присутності кераміки, що виготовлена методом мікрохвильового спікання, порівняно з керамікою, отриманою методом традиційного спікання, де спостерігалось пригнічення остеогенної активності.

Проведено сравнительное исследование эффективности клонирования стволовых стромальных клеток костного мозга человека в присутствии образцов керамики на основе биогенного гидроксиапатита, полученных методами традиционного и микроволнового спекания. Для оценки эффективности клонирования был использован метод клонирования остеогенных клеток-предшественников костного мозга по А.Я. Фриденштейну в модификации В.С. Астаховой. Установлено существенное увеличение показателей остеогенной активности стволовых стромальных клеток костного мозга подвздошной кости человека в присутствии керамики, полученной методом микроволнового спекания, по сравнению с керамикой, полученной методом традиционного спекания, где наблюдалось угнетение остеогенной активности.

There was performed a comparative study of effectiveness of cloning human marrow stem stromal cells in the presence of ceramic patterns of biogenous hydroxyapatite received by traditional and microwave sintering. To estimate cloning effectiveness we used the Fridenstein’s method of cloning osteogenous precursor cells modified by V.S. Astakhova. There was determined a significant enhancement in osteogenous activity of human iliac stem stromal cells in the presence of ceramics received by microwave sintering compared to the ceramics obtained by traditional method with inhibited osteogenous activity observed.


Ключевые слова

гідроксіапатит, мікрохвильове спікання, стовбурові стромальні клітини кісткового мозку, ефективність клонування.

гидроксиапатит, микроволновое спекание, стволовые стромальные клетки костного мозга, эффективность клонирования.

hydroxyapatite, microwave sintering, marrow stem stromal cells, cloning effectiveness

doi: http://dx.doi.org/10.22141/1608-1706.4.17.2016.77488

Статтю опубліковано на с. 45-49

 

Публікація містить результати досліджень, проведених за грантом Президента України за конкурсним проектом F63-3761 Державного фонду фундаментальних досліджень, а також за договором про наукову співпрацю між Інститутом проблем матеріалознавства ім. І.М. Францевича НАН України та ДУ «Інститут травматології та ортопедії НАМН України».

На сьогодні актуальним в ортопедії й травматології залишається пошук матеріалів для заміщення дефектів кісткової тканини, що утворились у результаті травм та їх ускладнень, інфекційних і онкологічних захворювань кісток. Серед різноманіття імплантаційних матеріалів особливе місце займають композиції на основі гідроксіапатиту (ГА) як синтетичного, так і біогенного (біологічного) походження завдяки його біосумісності та хімічній близькості до мінеральної складової природної кістки. Для отримання ГА кераміки використовують різні методи, такі як традиційне та мікрохвильове спікання, гаряче пресування, іскрове плазмове спікання, метод дублювання структури полімерної матриці та інші [3, 7, 11].
Одним із перспективних способів отримання кераміки різного функціонального призначення, у тому числі й медичного, з підвищеними механічними та біологічними властивостями є спікання в середовищі мікрохвиль. Застосування останніх не лише дозволяє покращити властивості кераміки, але й суттєво знизити енергозатрати на виробництво завдяки зменшенню тривалості термообробки матеріалу [5, 8, 10].
У нашій попередній роботі [12], присвяченій порівняльному дослідженню структури та властивостей зразків кераміки на основі біогенного гідроксіапатиту (БГА), отриманих методом мікрохвильового та традиційного спікання, було встановлено, що мікрохвильове спікання БГА в інтервалі температур 800−1100 °С значно знижує (у 2 рази) розмір зерна в кераміці порівняно з традиційним спіканням, збільшує міцність на стискання кераміки та її розчинність у фізіологічному розчині зі збереженням при цьому фазового складу.
Відомо, що культура стовбурових стромальних клітин (ССК) кісткового мозку людини є класичною моделлю для вивчення безпосереднього впливу фізичних та хімічних (у тому числі фармакологічних та кістковозамінних) чинників ex vivo [4, 9]. У культурі колонієутворюючих одиниць фібробластів (КУОф) кісткового мозку людини протягом 14 діб відбувається повний цикл диференціації від ранніх попередників до остеобластів [6]. Для оцінки ефективності клонування ССК кісткового мозку людини в присутності зразків кераміки на основі БГА, які отримані методами традиційного та мікрохвильового спікання, було використано метод клонування остеогенних клітин-попередників кісткового мозку за А.Я. Фріденштейном у модифікації В.С. Астахової [1, 2].
Мета роботи — дослідити ефективність клонування стовбурових стромальних клітин кісткового мозку людини в присутності зразків кераміки на основі біогенного гідроксіапатиту, що виготовлені методами традиційного та мікрохвильового спікання.

Матеріали і методи

Вихідним матеріалом для отримання зразків кераміки був біогенний гідроксіапатит «Остеоапатит керамічний» (Україна) з розміром частинок до 160 мкм. Зразки циліндричної форми отримували методом двостороннього пресування при тиску 200 МПа. Спікання проводили у високотемпературній мікрохвильовій муфельній печі (1,5 кВт, 2,45 ГГц) та в муфельній печі СНОЛ при температурі 900 °С з витримкою при максимальній температурі протягом 30 хв.
Для дослідження ефективності клонування ССК кісткового мозку людини в присутності кераміки на основі БГА використовували суспензію ядровмісних клітин кісткового мозку зі спонгіози крила клубової кістки пацієнтів ортопедичного профілю поза осередками локального запалення та дегенеративно-дистрофічного ураження. Клітини кісткового мозку вимивали зі спонгіози в середовищі 199 на магнітній мішалці протягом 30 хв. Клонування КУОф проводили з використанням фідеру — летально опромінених клітин кісткового мозку кролика. Культивування проводили в чашках Петрі у живильному середовищі 199 з 20% умістом сироватки крові людини, при 37 °С протягом 14 діб без зміни живильного середовища. Культури, які виросли, фіксували 96% етанолом, забарвлювали за Романовським — Гімзою. Результати оцінювали за показником ефективності клонування стромальних фібробластів кісткового мозку серед 105 ядерних клітин — співвідношення кількості колоній, які виросли, до кількості клітин, які було посаджено в чашку Петрі. За колонію приймали скупчення клітин, що містить не менше 50 фібробластів. Ефективність клонування КУОф кісткового мозку (ЕКУОф) розраховували за формулою:
Контролем служили культури таких самих клітин, які були вирощені в аналогічних (стандартних) умовах без додавання зразків кераміки.

Результати і обговорення

На рис. 1 наведено структури зламів зразків БГА-кераміки, отриманих методом скануючої електронної мікроскопії (мікроскоп РЭМ-106И (ВАТ «SELMI», Україна)), залежно від методу їх термообробки.
Як видно з наведених мікрофотографій, для зразків, отриманих методом мікрохвильового спікання, характерною є більш однорідна структура з рівномірним розподілом зерен та пор. У нашій роботі [12] було показано, що методом традиційного спікання отримати зразки з рівномірною структурою вдається лише при 1100 °С. Це може свідчити про те, що мікрохвилі спричиняють руйнування нестійких агломератів часток та утворення дрібнозернистої однорідної структури при низьких температурах спікання, тоді як при традиційному спіканні однорідна структура утворюється більшою мірою за рахунок дифузійних процесів, для перебігу яких необхідні вищі температури. Таким чином, мікрохвильове спікання дозволяє отримати зразки з рівномірною структурою при значно нижчих температурах, ніж традиційне спікання, що може дати значний економічний ефект при виготовленні керамічних виробів із БГА.
Крім того, у нашій попередній роботі [12] було встановлено, що зразки БГА-кераміки, отримані методом мікрохвильового спікання, мають пористість 40 % та міцність на стискання 37 МПа, що в 1,6–2 рази вище, ніж при традиційному спіканні. Дослідження in vitro показали, що при 36,5 ± 0,5 °С швидкість розчинення у фізіологічному розчині (0,9% NaCl) зразків, спечених у середовищі мікрохвиль, в 1,8 раза перевищує цей показник у зразків, отриманих методом традиційного спікання (рис. 2). Це, на нашу думку, може бути пов’язане з особливостями структуроутворення при мікрохвильовому спіканні.
На рис. 3 зображено колонії ССК кісткового мозку, вирощених протягом 14 діб у присутності зразків БГА-кераміки, що отримані методами мікрохвильового та традиційного спікання, а також у контрольних чашках. Результатами клонування стромальних фібробластів кісткового мозку були різні за величиною одно- та багатошарові колонії. Слід відзначити, що утворення найбільшої кількості колоній, переважно багатошарових, відбувається в присутності зразків БГА-кераміки, спеченої з використанням мікрохвиль, порівняно з контролем, а також зі зразками кераміки, виготовленими традиційним спіканням, для яких характерним виявився найменший ріст колоній, здебільшого одношарових.
Величини ефективності клонування ССК кісткового мозку серед 105 ядерних клітин у контролі та в присутності БГА-кераміки наведено на рис. 4. Як показали результати проведених досліджень, найвища ефективність клонування остеогенних клітин-попередників кісткового мозку людини спостерігається у присутності кераміки, отриманої методом мікрохвильового спікання при температурі 900 °С. При цьому ефективність клонування майже в 2 рази вища за контрольні величини. У присутності зразків кераміки, спечених традиційно, спостерігається пригнічення росту та диференціації остеогенних клітин-попередників кісткового мозку. Відмінності в кількості колоній стромальних фібробластів статистично вірогідні.
Отже, зразки БГА-кераміки, отримані методом мікрохвильового спікання, не лише не пригнічують, але і сприяють активізації процесів проліферації та диференціювання остеогенних клітин-попередників кісткового мозку, що експериментально доводить можливість та доцільність клінічного застосування такого матеріалу для заміщення кісткових дефектів різного походження.

Висновки

Порівняльним дослідженням ефективності клонування стовбурових стромальних клітин кісткового мозку людини в присутності зразків БГА кераміки, які отримані різними методами спікання, встановлено, що в присутності зразків, виготовлених методом мікрохвильового спікання, ефективність клонування майже вдвічі вища, ніж у контролі. Додавання в культуральну систему зразків кераміки, отриманих традиційним спіканням, значно пригнічує ріст і диференціювання ССК кісткового мозку, навіть порівняно з контролем.
Кераміка на основі БГА, яка спечена в середовищі мікрохвиль, оптимізує процеси проліферації та диференціації остеогенних клітин-попередників кісткового мозку людини, що робить цей матеріал перспективним для медичного застосування.

Список литературы

1. Астахова В.С. Остеогенные клетки-предшественники костного мозга человека / Астахова В.С. — К.: Феникс, 2000. — 176 с.

2. Коваленко В.Н. Культура стволовых стромальных клеток костного мозга человека как модель для изучения прямого влияния фармакологических препаратов при остеоартрозе / В.Н. Коваленко, И.В. Лысенко, Л.М. Панченко // Український ревматологічний журнал. — 2006. — № 3 (25). — C. 45-48.

3. Сафронова Т.В. Медицинское неорганическое материаловедение в России: кальцийфосфатные материалы / Т.В. Сафронова, В.И. Путляев // Наносистемы: физика, химия, математика. — 2013. — 4 (1). — С. 24-47.

4. Bellucci D. A Revised replication method for bioceramic scaffolds / D. Bellucci, A. Sola, V. Cannillo // Bioceramics Development and Applications. — 2011. — Vol. 1. — Р. 1-8.

5. Dasgupta S. Effect of grain size on mechanical, surface and biological properties of microwave sintered hydroxyapatite / S. Dasgupta, S. Tarafder, A. Bandyopadhyay [et al.] // Materials Science and Engineering: C. — 2013. — Vol. 33, № 5. — P. 2846-2854.

6. Gerhardt L.-C. Bioactive glass and glass-ceramic scaffolds for bone tissue engineering / L.-C. Gerhardt, A.R. Boccaccini // Materials. — 2010. — Vol. 3. — P. 3867-3910.

7. Hammel E.C. Processing and properties of advanced porous ceramics: An application based review / E.C. Hammel, O.L.-R. Ighodaro, O.I. Okoli // Ceramics Internatio-nal. — 2014. — Vol. 40, Issue 10. — P. 15351-15370.

8. Kalita S.J. Nanocrystalline hydroxyapatite bioceramic using microwave radiation: Synthesis and characterization / S.J. Kalita, S. Verma // Materials Science and Engine-ering: C. — 2010. — Vol. 30, № 2. — P. 295-303.

9. Kokubo T. Bioceramics and their clinical applications / T. Kokubo. — Boca Raton; Boston; New York; Washington, DC: CRC Press LLC, 2008. — 760 р.

10. Nazira R. Rapid synthesis of thermally stable hydroxyapatite / R. Nazira, N. Iqbala, A.S. Khana [et al.] // Ceramics International. — 2012. — Vol. 38, № 1. — P. 457-462.

11. Sadat-Shojai M. Synthesis methods for nanosized hydroxyapatite with diverse structures / M. Sadat-Shojai, M.-T. Khorasani, E. Dinpanah-Khoshdargi, A. Jamshidi // Acta Biomaterialia. — 2013. — Vol. 9, Issue 8. — P. 7591-7621.

12. Tovstonog G.B. The Structure and properties of biogenic hydroxyapatite ceramics: microwave and conventional sintering / G.B. Tovstonog, O.E. Sych, V.V. Skorokhod // Powder Metallurgy and Metal Ceramics. — 2015. — Vol. 53, Issue 9. — P. 566-573.


Вернуться к номеру