Резюме
Мета. Встановлення динаміки клінічно-лабораторних характеристик і функціонального стану периферичних нервів у хворих на цукровий діабет типу 2 (ЦД-2), ускладнений дистальною симетричною полінейропатією (ДСПН) залежно від розподілу частот генотипів G894Т поліморфізму гена ендотеліальної NO-синтази на тлі рекомендованого лікування. Матеріали та методи. Обстежено 110 хворих із ДСПН на тлі ЦД-2, що становили основну групу, та 80 практично здорових осіб. Розподіл хворих здійснювався за ступенем тяжкості ДСПН: із початковими проявами полінейропатії — 32 (29,1 %), з помірним ступенем — 58 (52,7 %) та з вираженим ступенем — 20 (18,2 %) осіб. Пацієнти отримували препарат L-аргінін на тлі базисного лікування. Проводилося неврологічне обстеження за шкалами нейропатичного симптоматичного підрахунку, модифікованого нейропатичного дисфункціонального підрахунку, електронейроміографічне тестування периферичних нервів нижніх кінцівок, визначалися показники вуглеводного обміну, про- та антиоксидантного захисту, функціонального стану ендотелію. Результати. Гомозиготність за мінорною алеллю Т підвищує ймовірність розвитку ДСПН на тлі ЦД-2: відношення шансів становило 2,91 (95% довірчий інтервал 1,19–7,14; р < 0,05). У пацієнтів із генотипами GT і GG поліморфізму G894T гена ендотеліальної NO-синтази визначається найбільш висока ефективність рекомендованої терапії на противагу носіям ТТ-генотипу, у яких динаміка клінічно-лабораторних і функціональних параметрів була найнижчою. Висновки. Гомозиготність за мінорною алеллю Т поліморфізму G894Т гена ендотеліальної NO-синтази підвищує частоту розвитку, тяжкість перебігу ДСПН на тлі ЦД-2, а також пов’язана з менш стійким ефектом від лікування цього ускладнення.
Цель. Определение динамики клинико-лабораторных характеристик и функционального состояния периферических нервов у больных сахарным диабетом типа 2 (СД-2), осложненного дистальной симметричной полинейропатией (ДСПН), в зависимости от распределения частот генотипов G894Т полиморфизма гена эндотелиальной NO-синтазы на фоне рекомендуемой терапии. Материалы и методы. Обследованы 110 больных, которые были распределены на группы в зависимости от степени тяжести ДСПН: с начальными проявлениями — 32 (29,1 %), с умеренной степенью — 58 (52,7 %), с выраженной степенью — 20 (18,2 %). Пациенты получали препарат L-аргинин на фоне базисного лечения. Проводилось неврологическое обследование по шкалам нейропатического симптоматического счета, модифицированного нейропатического дисфункционального счета, электронейромиографическое тестирование периферических нервов нижних конечностей, определялись показатели углеводного обмена, про- и антиоксидантной защиты, функционального состояния эндотелия. Результаты. У больных с ДСПН на фоне СД-2 гомозиготность по минорной аллели Т полиморфизма G894T гена эндотелиальной NO-синтазы повышает вероятность развития диабетической полинейропатии: отношение шансов составило 2,91 (95% доверительный интервал 1,19–7,14; р < 0,05). У пациентов с генотипами GT и GG определяется наиболее высокая эффективность рекомендуемой терапии в противовес больным с гомозиготным ТТ-генотипом, у которых динамика клинико-лабораторных и функциональных значений была значительно ниже. Выводы. Гомозиготность по минорной аллели Т полиморфизма G894Т гена эндотелиальной NO-синтазы повышает частоту развития, тяжесть течения ДСПН на фоне СД-2, а также связана с менее устойчивым эффектом от лечения этого осложнения.
Background. The purpose of the study is to determine the dynamics of clinical and laboratory characteristics and functional state of peripheral nerves in patients with type 2 diabetes mellitus (DM) complicated by distal symmetrical polyneuropathy (DSPN) depending on the frequency distribution of the G894T genotypes of endothelial NO-synthase (eNOS) gene polymorphism during the recommended therapy. Materials and methods. 110 patients were examined, they were divided into groups: with initial manifestations of DSPN — 32 (29.1 %), with moderate course — 58 (52.7 %) and with severe course — 20 (18.2 %). Patients received L-arginine preparation during basic treatment. All patients were neurologically examined using Neuropathic Symptomatic Score, Neuropathic Dysfunctional Score, electroneuromyographic testing of the peripheral nerves of the lower extremities; parameters of carbohydrate metabolism, pro- and antioxidant defense, functional state of the endothelium were evaluated. Results. In patients with DSPN and type 2 DM, homozygotes for the minor T allele of the eNOS gene G894T polymorphism, the likelihood of developing severe complications of diabetic polyneuropathy increases: the odds ratio was 2.91 (95 % confidence interval 1.19–7.14; p < 0.05). In patients with GT and GG genotypes, the highest efficacy of the recommended therapy is determined, in contrast to patients with homozygous TT genotype, whose dynamics of clinical, laboratory and functional indicators was significantly lower. Conclusions. Homozygotes for the minor T allele of the eNOS gene G894T polymorphism have an increase in the incidence and the severity of DSPN course on the background of type 2 DM, and also a less stable effect from the treatment of this complication.
Вступ
Одним із найбільш поширених і складних у лікуванні ускладнень цукрового діабету (ЦД) є діабетична дистальна симетрична полінейропатія (ДСПН). За визначенням Всесвітньої організації охорони здоров’я, ДСПН — захворювання, що характеризується прогресуючою втратою нервових волокон і призводить до втрати чутливості й розвитку виразок стопи [1, 2]. Поширеність ДСПН, за даними різних авторів, перебуває в межах від 15,5 до 77,6 % за відсутності інших причин її виникнення [3, 4].
У наш час ДСПН належить до об’єктів інтенсивних генетичних досліджень. Відомо, що поліморфізм генів, які детермінують функціональний стан ендотелію, є причиною схильності організму до розвитку різних патологічних станів, насамперед до ангіопатій [5]. Ген ендотеліальної NO-синтази (eNOS), відповідає за синтез монооксиду нітрогену (NO) ендотелієм і є ключовим ферментом у регуляції тонусу кровоносних судин, у роботі гладком’язової мускулатури судинної стінки [7, 8]. У зв’язку цим саме поліморфізм G894Т гена eNOS може бути потенційним модифікатором діабетичних ангіопатій і чинником ішемізації нервової тканини.
Отже, надзвичайно важливим стає удосконалення терапевтичної концепції лікування пацієнтів із ДСПН на тлі ЦД типу 2 (ЦД-2), метою якої є відновлення адекватної біодоступності NO і, як результат, поліпшення ендотелійзалежної вазодилатації з урахуванням поліморфізму G894Т гена eNOS.
Мета: дослідження динаміки клінічно-лабораторних характеристик і функціонального стану периферичних нервів у хворих на ЦД-2, ускладнений дистальною симетричною полінейропатією залежно від розподілу частот генотипів G894Т поліморфізму гена ендотеліальної NO-синтази на тлі рекомендованого лікування.
Матеріали та методи
Обстежено 110 хворих із ДСПН на тлі ЦД-2, які становили основну групу. Середній вік хворих — 54,2 року (від 38 до 72 років). Чоловіків було 62, жінок — 48. До групи порівняння увійшло 80 практично здорових осіб віком від 32 до 56 років, зокрема 36 чоловіків і 44 жінки. Пацієнти на тлі базисного лікування отримували препарат L-аргінін, який призначали –перорально у дозі 5 г/добу впродовж трьох тижнів.
Розподіл хворих здійснювався за ступенем тяжкості ДСПН: перша група — з початковими проявами ДСПН — 32 (29,1 %) пацієнти; друга група — з помірним ступенем — 58 (52,7 %); третя група — з вираженим ступенем ДСПН — 20 (18,2 %).
Усім пацієнтам проводилося неврологічне обстеження за шкалами нейропатичного симптоматичного розрахунку (NSS) і нейропатичного дисфункціонального розрахунку (NDS) [9]. Електронейроміографічне (ЕНМГ) обстеження здійснювалося на комп’ютеризованому програмному комплексі М-ТEST («DX-системи», Україна), при цьому вивчали амплітуду потенціалів максимальної рухової відповіді (М-відповідь), швидкість проведення збудження, резидуальну латентність (мс) при дослідженні малогомілкового та великогомілкового нервів [10].
Рівень глікемії досліджували глюкозооксидазним методом із використанням стандартних наборів реактивів виробництва НВП «Філісітдіагностика» (Україна). Глікований гемоглобін (HbA1с) визначали методом рідинної іонообмінної хроматографії високого тиску на автоматичному аналізаторі D10 фірми Bio-Rad Laboratories Inc. (Франція). Рівень імунореактивного інсуліну і С-пептиду встановлювали імуноферментним методом на аналізаторі STAT-FaxPlus-303 (США) з використанням реактивів фірми DRG International Inc. (США).
Ступінь інсулінорезистентності встановлювали за індексом інсулінорезистентності HOMA-IR з використанням програми HOMA Calculator Version 2.2 Diabetes Trials Unit University of Oxford (Великобританія). Критичним вважалося значення понад 2,0.
Для оцінки активності окиснювальних процесів визначали вміст продуктів перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ), а саме за рівнем малонового альдегіду (МА) у плазмі крові та еритроцитах, відновленого глутатіону (Г-SH). Стан системи антиоксидантного захисту аналізували за визначенням активності каталази та глутатіонпероксидази [11].
Функціональний стан ендотелію досліджували за вмістом у крові стабільних метаболітів монооксиду нітрогену (NO) та кількістю циркулюючих у крові злущених ендотеліоцитів. При цьому кількість циркулюючих у крові ендотеліоцитів визначалася за методом J. Hladovec у модифікації Н.Н. Петрищева та співавт. Уміст у крові стабільних метаболітів NO (нітритів, нітратів) досліджували за вмістом нітрит-аніону (NO2–) і сумою NO2– та нітрат-аніону (NO3–) у сироватці венозної крові фотоколориметричним методом за L.C. Green et al.
ДНК виділяли з клітин крові за допомогою набору «ДНК-сорб-В» («АмпліСенс», Росія). Детекцію поліморфізму G894T в гені eNOS проводили методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Алельний поліморфізм визначали ампліфікацією гена з подальшою рестрикцією рестриктазою Есо24І. Фрагменти ампліфікованої ДНК розділяли методом гель-електрофорезу. Візуалізація ДНК проводилася за допомогою ультрафіолетового випромінювача. Підбір праймерів для ампліфікації та наступного секвенсу, а також аналіз ПЛР здійснювався відповідно до загальноприйнятих світових методик.
Статистична обробка проводилася з використанням прикладних програми MS Excel 2003, Biostat, Statistica 6. Вірогідність отриманих даних вираховували методом парного тесту із застосуванням t-критерію Стьюдента. Вірогідну відмінність у розподілі вибірок визначали за критерієм χ2. Значення р < 0,05 вважали вірогідним.
Результати
Аналіз поліморфізму довжини рестрикційних фрагментів дозволив виявити у проаналізованих зразках геномної ДНК три генотипи поліморфного локуса G894T гена eNOS. З’ясовано, що при розподілі частот генотипів залежно від поліморфізму G894T гена eNOS частота алелей G і T у групі хворих і контролі вірогідно не відрізнялася (χ2 = 1,32, р = 0,25) (табл. 1). Мажорною алеллю у досліджуваній групі була алель G: її частота становила у конт–рольній групі 0,631; у хворих на ЦД-2, ускладненим ДСПН, — 0,573. Відповідно в останній групі хворих спостерігали підвищення частоти мінорної алелі Т (0,427 проти 0,369).
Розподіл генотипів відповідав закону Hardy — Weinberg [12]: контрольна група — χ2 = 0,94, χ2 0,05 = 3,84 (р > 0,05); група хворих — χ2 = 0,82, χ2 0,05 = 3,84 (р > 0,05). При цьому у групі хворих спостерігали підвищену частку гомозигот за рідкісною алеллю ТТ (19,1 проти 8,7 %) (табл. 1). Також спостерігалося зниження гетерозиготних генотипів GT у групі хворих, що становило 41,8 проти 51,2 % у контролі.
Гомозиготність за мінорною алеллю Т підвищує ймовірність розвитку ДСПН на тлі ЦД-2: відношення шансів (odds ratio, OR) становило 2,91 (95% довір–чий інтервал (ДI) 1,19–7,14; р < 0,05).
Розподіл частот генотипів G894T поліморфізму гена eNOS залежно від ступеня тяжкості ДСПН поданий в табл. 2. У хворих із початковими проявами ДСПН гомозиготний генотип GG гена eNOS виявлений у 31,3 %, гетерозиготний GT — у 53,1 %; гомозиготний генотип за рідкісною алеллю ТТ був генотипований у 15,6 %. У хворих із помірним ступенем тяжкості генотипи розподілялися так: GG — у 37,9 %, GT — у 46,5 %, ТТ — у 15,5 %; у пацієнтів з вираженим ступенем ДСПН гомозиготний генотип GG спостерігався у 50 % осіб, гетерозиготний генотип GT — у 15 %; гомозиготний генотип ТТ за рідкісною алеллю був генотипований у 35 % осіб.
При розподілі основної групи хворих на ЦД-2 з ДСПН на підгрупи (табл. 2) виявлено, що кількість гомозиготних генотипів ТТ за рідкісною алеллю у осіб з вираженим ступенем ДСПН вірогідно переважала у 4,0 раза (χ2 = 4,568; р = 0,033) порівняно з контролем. Отже, гомозиготність за мінорною алеллю Т підвищує ймовірність розвитку ДСПН на тлі ЦД-2: OR становило 2,91 (95% ДI 1,19–7,14; р < 0,05).
Аналіз показників за шкалами суб’єктивної та об’єктивної симптоматики засвідчив вірогідно вищі параметри NSS у хворих із гомозиготним генотипом за рідкісною алеллю Т порівняно з носіями гетерозиготного генотипу GT на 19,3 % (р < 0,05).
Функціональний стан периферичних нервів у хворих на ЦД-2 з ДСПН був асоційований з поліморфізмом G894T гена еNOS: у пацієнтів з гомозиготним генотипом ТТ за рідкісною алеллю спостерігали найбільш виражені ознаки ураження осьового циліндра нервів, що проявлялися вірогідним зниженням амплітуди М-відповіді при ЕНМГ-тестуванні малогомілкових і великогомілкових нер–вів на 26,1 % порівняно з носіями гетерозиготного генотипу GТ (р ≤ 0,05).
При оцінці клінічно-діагностичних параметрів у всіх обстежених пацієнтів, які є носіями трьох генотипів (GG, GT, ТТ), відзначалася позитивна динаміка після курсу рекомендованого лікування: вірогідне зменшення суб’єктивних проявів і покращення об’єктивної симптоматики. Статистично вірогідне зниження показників за шкалою NSS через 3 тижні після лікування на 39,2 % (р < 0,01) спостерігалося у хворих із генотипом GT, на 40,0 % (р < 0,01) — з генотипом GG і на 35,3 % (р < 0,05) — у хворих із генотипом ТТ. Однак слід зазначити, що у хворих із гомозиготним генотипом ТТ частота проявів суб’єктивної симптоматики через 6 місяців після лікування знову наростала та була ідентичною початковому рівню (6,30 ± 0,37 бала). При оцінці показників NDS вірогідна динаміка через 3 тижні після лікування відзначалася у хворих із генотипом GT (зниження на 24,5 %; р < 0,05), що вказує на більш високу ефективність рекомендованого лікування у цієї групи хворих.
При дослідженні впливу рекомендованого лікування на вуглеводний обмін у обстежених хворих залежно від частоти розподілу генотипів G894T поліморфізму гена еNOS встановлено, що після лікування у хворих із генотипами GG і GT відзначалося вірогідне зниження рівня HbA1c та С-пептиду (р < 0,05), що вказує на адекватність та ефективність терапії у цих групах хворих, чого не спостерігалося у хворих із гомозиготним генотипом за мінорною алеллю Т.
При порівняльній оцінці показників про- та антиоксидантних систем крові виявлено, що в усіх обстежених хворих спостерігалося вірогідне зниження інтенсивності ПОЛ через 3 тижні після лікування: зниження рівня МА на 23,3 % — у хворих із генотипом GT, на 34,7 % — з генотипом GG і на 35,5 % — з генотипом ТТ (р < 0,05). Параметри антиоксидантного захисту (відновлений глутатіон) на тлі рекомендованого лікування вірогідно підвищуються у хворих із генотипами GT і GG на 22,2 та 21,3 % (р < 0,05) відповідно. У пацієнтів зі встановленим генотипом ТТ вірогідного зростання вмісту Г-SH нами не спостерігалося, що вказує на виражене виснаження антиоксидантної системи (АОС) та малу ефективність терапії щодо даного біохімічного показника у зазначеній групі пацієнтів.
Функціональний стан ендотелію у хворих із ДСПН на тлі ЦД-2 залежно від розподілу частот генотипів поліморфізму G894T гена еNOS в динаміці рекомендованого лікування досліджували за вмістом у крові NO та кількістю циркулюючих у крові злущених ендотеліоцитів. Оцінка показників NO в обстежених усіх трьох генотипів до та після лікування вірогідно не різнилася. Аналіз вмісту кількості десквамованих ендотеліоцитів у хворих до та після лікування показав, що даний показник вірогідно знижувався у пацієнтів з генотипом GT на 37,9 % (р < 0,05), що свідчить про досить високу ефективність рекомендованої терапії у пацієнтів з відповідним генотипом щодо покращення функції ендотелію.
При оцінці динаміки показників функціонального стану периферичних нервів у носіїв трьох генотипів встановлено, що через 3 тижні після лікування не відзначається виражених змін показників ЕНМГ-тестування периферичних нервів нижніх кінцівок (р > 0,05), проте у хворих із генотипом GT і GG показники аксонопатії (підвищення амплітуд на 13,1 та 13,3 % порівняно з показниками до лікування проти 9,9 % у хворих із генотипом ТТ) були менш вираженими порівняно з носіями гомозиготного генотипу за мінорною алеллю.
Обговорення
Отже, за даними нашого дослідження, у пацієнтів з генотипами GT і GG поліморфізму G894T гена ендотеліальної NO-синтази визначається найбільш висока ефективність рекомендованої терапії, на противагу хворим із генотипом за мінорною алеллю Т, у яких динаміка клінічно-лабораторних і функціональних параметрів була найнижчою.
Підвищує ймовірність розвитку ДСНП на тлі ЦД-2 гомозиготність за мінорною алеллю Т поліморфізму G894Т гена ендотеліальної NO-синтази. У той же час носії GT і GG мають кращий перебіг та найбільш низький ризик розвитку тяжких ускладнень діабетичної полінеропатії.
L-аргінін у комплексному лікуванні хворих із ДСПН призводить до поліпшення клінічного перебігу захворювання зі зменшенням суми балів за шкалою NSS на 36,8 % і за шкалою NDS на 37,1 % через 3 місяці після лікування, справляє позитивний вплив на функціональний стан периферичних нервів нижніх кінцівок за даними ЕНМГ, позитивно впливає на основні патогенетичні ланки захворювання із пригніченням процесів ПОЛ і поліпшенням функціонального стану ендотелію.
Встановлено, що ефект від лікування хворих із ДСПН через 6 місяців за основними клінічно-діагностичними параметрами найменш стійкий у носіїв гомозиготного генотипу за мінорною алеллю поліморфізму G894T гена ендотеліальної NO-синтази. Це вказує на доцільність проведення повторного курсу лікування для цієї категорії пацієнтів.
Висновки
1. Гомозиготність за мінорною алеллю Т поліморфізму G894Т гена ендотеліальної NO-синтази підвищує ймовірність розвитку дистальної симетричної полінейропатії на тлі ЦД-2. В свою чергу, носії GT і GG мають кращий перебіг та найбільш низький ризик розвитку ускладнень діабетичної полінеропатії.
2. Застосування у комплексному лікуванні хворих із ДСПН препарату L-аргінін сприяє покращенню клінічного перебігу захворювання зі зменшенням суми балів за шкалою NSS на 36,8 % (р < 0,05) та за шкалою NDS на 37,1 % (р < 0,05) через 3 місяці після лікування, позитивно впливає на функціональний стан периферичних нервів нижніх кінцівок за даними ЕНМГ (вірогідне збільшення амплітуди моторної відповіді на 18 %; р < 0,05), позитивно впливає на основні патогенетичні ланки захворювання із пригніченням процесів ПОЛ (зниження рівня МА плазми на 21,4 % та еритроцитів на 34,9 %; р < 0,05), підвищенням активності захисної АОС (збільшення вмісту відновленого глутатіону на 19,5 %; р < 0,01) та покращенням функціонального стану ендотелію.
3. За основними клінічно-діагностичними параметрами ефект від лікування хворих із ДСПН через 6 місяців найменш стійкий у носіїв гомозиготного генотипу за мінорною алеллю поліморфізму G894T гена ендотеліальної NO-синтази, що вказує на доцільність проведення повторного курсу лікування для цієї категорії пацієнтів.
Конфлікт інтересів. Автори заявляють про відсутність конфлікту інтересів при підготовці даної статті.
Список литературы
1. Vinik A., Nevoret M.L., Casellini C. et al. Diabetic neuropathy // Endocrinol. Metab. Clin. North Am. — 2013. — Vol. 42(4). — P. 747-787. doi: 10.1016/j.ecl.2013.06.001.
2. Volmer-Thole M., Lobmann R. Neuropathy and Diabetic Foot Syndrome // Int. J. Mol. Sci. — 2016. — Vol. 17(6). doi. 10.3390/ijms17060917.
3. Alleman C.J., Westerhout K.Y., Hensen M. et аl. Huma–nistic and economic burden of painful diabetic peripheral neuropathy in Europe: A review of the literature // Diabetes Res. Clin. Pract. — 2015. — Vol. 109(2). — P. 215-225. doi: 10.1016/j.diabres.2015.04.031.
4. Vinik A.I. Diabetic sensory and motor neuropathy // N. Engl. J. Med. — 2016. — Vol. 374. — P. 1455-1464. doi: 10.1056/NEJMcp1503948.
5. Witzel I.I., Jelinek H.F., Khalaf K., Lee S., Khando–ker A.H., Alsafar H. Identifying Common Genetic Risk Factors of Diabetic Neuropathies // Front. Endocrinol. (Lausanne). — 2015. — Vol. 6. — P. 88. doi: 10.3389/fendo.2015.00088
6. Corapcioglu D., Sahin M., Emral R. et al. Association of the G894T Polymorphism of the Endothelial Nitric Oxide Synthase Gene with Diabetic Foot Syndrome Foot Ulcer, Diabetic Complications, and Comorbid Vascular Diseases: A Turkish Case-Control Study // Genet Test Mol. Biomarkers. — 2010. — Vol. 14(4). — P. 483-488.
7. Angeline T., Krithiga H.R., Isabel W. et al. Endothelial Nitric Oxide Synthase Gene Polymorphism (G894T) and Diabetes Mellitus (Type II) among South Indians // Oxidative Medicine and Cellular Longevity. — 2011. http://dx.doi.org/ 10.1155/2011/462607.
8. Forstermann U., Sessa W. Nitric oxide synthases: regulation and function // European Heart Journal. — 2012. — Vol. 33. — P. 829-837.
9. Asad A., Hameed M.A., Khan U.A., Ahmed N., Butt M.U. Reliability of the neurological scores for assessment of sensorimotor neuropathy in type 2 diabetics // J. Pak. Med. Assoc. — 2010. — Vol. 60(3). — P. 166-70.
10. Butugan M.K., Sartor C.D., Watari R., Martins M.C. Multichannel EMG-base destimation of fiber conduction velo–city during isometric contraction of patients with different stages of diabetic neuropathy // J. Electromyogr. Kinesiol. — 2014. — Vol. 24(4). — P. 465-72.
11. Мокрій В.Я. Особливості формування окисного стресу у хворих на цукровий діабет типу 2 залежно від тривалості захворювання та статі / В.Я. Мокрій, С.В. Зябліцев, М.В. Кришталь // Міжнародний ендокринологічний журнал. — 2016. — № 5(77). — С. 67-71. doi: 10.22141/2224-0721.5.77.2016.78757.
12. Mayo O. A century of Hardy-Weinberg equilibrium // Twin. Res. Hum. Genet. — 2008. — Vol. 11(3). — P. 249-256.
/14-1.jpg)