Журнал «Здоровье ребенка» Том 13, №7, 2018

Введение

Этиология хронических болезней клубочкового аппарата почки на сегодняшний день до конца не известна. Описано участие ряда факторов, в том числе вирусных инфекций [1–5]. Внимание к роли вирусов гепатита В и С в развитии гломерулонефрита знаменовало начало изучения вирусассоци–ированных нефропатий [2]. По данным литературы прослежена связь между инфекцией, вызванной вирусами семейства герпесвирусов (вирус простого герпеса (ВПГ), Эпштейна — Барр (ВЭБ), цитомегаловирус (ЦМВ)) и развитием как самого заболевания, так и провокацией обострений [4–7]. Среди приведенных — нефротический синдром, системные заболевания соединительной ткани (системная красная волчанка (СКВ)), ревматоидный артрит, системные васкулиты (IgA-васкулит Шенлейна — Геноха (ШГ), гранулематоз Вегенера и др.), а также развитие криза отторжения, лимфопролиферативных заболеваний у пациентов с трансплантированной почкой [8–15]. H. Shimohata и соавт. отражают вклад парвовируса В19 в развитие нефропатии [16].

Показано, что ВИЧ непосредственно участвует в патогенезе гломерулопатии, хотя механизм этого до конца не ясен. ВИЧ-нефропатия встречается у 2–10 % ВИЧ-инфицированных, в большинстве случаев проявляется протеинурий или нефротическим синдромом, морфологически фокально-сегментарным гломерулосклерозом [2–5].

Рядом авторов показана связь гломерулярного поражения вирусами и торпидного течения гломерулопатии (ГП), развития резистентности к проводимой гормональной и цитостатической терапии, ухудшения прогноза [2–5].

Целью настоящего исследования явилось определение антител (АТ) к ВЭБ (IgG к нуклеарному и раннему антигену (АГ), IgG и IgM к вирусному капсидному АГ), ЦМВ (IgG, IgM), ВПГ (IgM, IgG), специфических фрагментов ДНК герпес- и полиомавирусов (ПВ) (BKV, JCV) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в сыворотке крови и ткани почки для уточнения роли вирусной инфекции в развитии ГП у детей.

Материалы и методы

Нами проведено обследование 130 детей с ГП на наличие АТ и фрагментов ДНК герпес- и полиомавирусов, а также электронно-микроскопический (ЭМ) анализ нефробиоптатов пациентов с первичными и вторичными ГП. В качестве контроля обследовано 36 условно здоровых детей без патологии клубочкового аппарата почки, находившихся на обследовании в отделении кардиологии с диагнозом «вегетативная дистония».

Первую исследуемую группу составил 41 пациент с вторичными ГП вследствие СКВ, люпус-нефрита (ЛН) (n = 20), IgA-васкулита Шенлейна — Геноха (n = 17), с АНЦА-ассоциированным нефритом, гранулематозом Вегенера (n = 4). Одиннадцать детей с СКВ, ЛН были обследованы повторно в динамике. Во вторую исследуемую группу вошли пациенты (n = 47) с первичными ГП — IgA-нефропатией (IgAN, n = 18), нефропатией минимальных изменений (n = 15), фокально-сегментарным гломерулосклерозом (n = 14). Третья исследуемая группа — реципиенты почечного трансплантата (Тх, n = 42). Возраст пациентов варьировал от 2 до 18 лет (13,2 ± 4,1 года).

Методом ПЦР ДНК-содержащих вирусов проведено исследование 42 сывороток крови и 21 образца мочи детей с Тх на наличие полиомавирусов BKV, JCV (в качестве группы сравнения для детей с ГП (n = 88)).

Обследование и забор биологического материала (нефробиоптатов, сыворотки крови, мочи) проводились на базе нефрологического отделения УЗ «2-я детская городская клиническая больница» г. Минска и 1-й кафедры детских болезней УО БГМУ. Серологические, молекулярно-биологические и ЭМ-исследования проводились на базе лаборатории вирусных инфекций РНПЦ эпидемиологии и микробиологии. У всех пациентов диагноз ГП верифицирован с проведением световой и иммуногистохимической микроскопии.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Для выявления специфических антител к вирусам семейства Herpesviridae использовали тест-системы «ВектоВПГ-IgG», «ВектоВПГ-IgM», «ВектоЦМВ-IgG», «ВектоЦМВ-IgМ», «ВектоВЭБ-VCA-IgM», «ВектоВЭБ-EA-IgG». Постановку реакций проводили в соответствии с инструкциями по применению, прилагаемыми производителем («Вектор-Бест», Россия). Учет результатов проводили на ИФА-анализаторе «АИФ-М/340» («Витязь», Республика Беларусь) при длине волны 450 нм.

Полимеразная цепная реакция. Выделение ДНК проводили с помощью комплекта реагентов «РИБО-преп» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия). Наличие ДНК герпесвирусов определяли с использованием ПЦР наборов «АмплиСенс HSVI, II-EPh», «АмплиСенс CMV-EPh» и «АмплиСенс EBV-EPh» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия).

Выделение ДНК полиомавирусов, в том числе BKV и JCV, проводилось в лаборатории инфекций с природным резервуаром. Проведение реакций и оценка результатов — согласно прилагаемым к наборам инструкциям.

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием программы Statistica 10.0. Вычисляли среднеарифметические величины, их доверительные интервалы, оценку достоверности различий числовых результатов по критерию Стьюдента. Разницу считали статистически достоверной при р < 0,05.

Результаты

Серологическая диагностика (ИФА). В контрольной группе IgM к ВПГ не были выявлены ни в одном образце. В то же время у 2 из 36 (5,5 %) обследуемых обнаружены IgM к ЦМВ, у 3 из 36 (8,3 %) — IgM к ВЭБ. IgG к капсидному АГ ВЭБ не были выявлены ни у одного пациента контрольной группы. Клинически ни у одного пациента не отмечалось признаков герпесвирусной инфекции.

В 1-й исследуемой группе у 7 из 41 (17,1 %) и во 2-й исследуемой группе у 6 из 47 (12,8 %) детей выявлены IgM к ВПГ, у 8 (20 %) из 1-й и у 8 (17 %) из 2-й группы — IgM к ЦМВ. IgM к вирусу Эпштейна — Барр в 1-й и 2-й группах выявлены у 6 (15 %) и 5 (10,1 %) обследуемых соответственно.

Среди детей с Тх почкой IgM к ВПГ не были обнаружены ни у одного пациента, к ЦМВ определялись у 2 (5 %), к ВЭБ — у 3 (7 %) детей.

В 4 случаях (9,8 %) из 1-й группы (дети с СКВ, ЛН) были выявлены одновременно IgM к ЦМВ и ВЭБ. IgM к ЦМВ, ВПГ и ВЭБ одновременно определялись у одного пациента из 1-й исследуемой группы (мальчик с нефритом ШГ без активной патогенетической терапии в момент исследования).

IgG ЕА к ВЭБ были выявлены у 11 (26,8 %) пациентов из 1-й группы, во 2-й группе — у 8 детей (17 %), у 15 (35,7 %) пациентов с Тх почкой, в контроле — у 3 (8,3 %).

Серопозитивными по IgG к ВПГ в 1-й группе были 73,2 % обследуемых (30 из 41), во 2-й группе — 57,4 % (27 из 47), в 3-й группе — 50 % (21 из 42), в контрольной — 22,2 % (8 из 36). Серопозитивными по IgG к ЦМВ в 1-й группе — 53,7 % (22 из 41), во 2-й — 34,04 % (16 из 47), в 3-й — 67 % (28 из 42), в контроле — 44,4 % (16 из 36).

Выявляемость АТ классов IgМ и IgG к герпесвирусам у здоровых, детей с ГП, реципиентов почечного Тх представлена в табл. 1.

У 2 девочек с СКВ, ЛН в сыворотке крови не было выявлено АТ ни класса М, ни G. У обеих отмечалась высокая активность волчанки, IV класс нефрита, протеинурия нефротического уровня, обе получали высокодозную патогенетическую терапию индукции нефрита (пульс-терапию циклофосфамидом 500 мг/м² 1 раз в месяц и преднизолоном в дозе 2 мг/кг/сут). Исследование крови было проведено в динамике, после завершения 6 курсов циклофосфамида и перехода на азатиоприн. У обеих появилась положительная ПЦР к ВЭБ, АТ не определялись. В течение заболевания отмечалась тенденция к лейкопении, в связи с чем в процессе лечения приходилось отменять азатиоприн и увеличивать дозу преднизолона.

У пациентки М. с СКВ, ЛН, получавшей терапию преднизолоном и азатиоприном, при первичном обследовании определялись IgМ и G к ВПГ, ВЭБ IgG EA, положительная ПЦР к ВПГ. СКВ характеризовалась резистентностью к проводимой терапии. Сразу после взятия крови пациентка развернула клинику ветряной оспы, причем в анамнезе у девочки уже отмечена перенесенная ранее ветряная оспа, что потребовало отмены иммуносупрессивной (ИС) терапии. Ассоциация иммуноопосредованной ГП с герпесвирусной инфекцией на фоне проводимой ИС привела к вторичному транзиторному иммунодефициту, что повлекло повторное развитие инфекционного процесса.

У девочки У. в сыворотке крови выявлены IgG к ВПГ, IgG EA ВЭБ, положительная ПЦР к ВЭБ крови и мочи, а также вирусные частицы в нефробиоптате. При повторном исследовании крови все антитела и ПЦР были отрицательными, что можно связать с длительной ИС-терапией.

Нами установлено, что IgM к ВПГ и IgM к ЦМВ чаще выявлялись в сыворотках пациентов исследуемых групп с вторичными и первичными ГП по сравнению с контрольной (17,1 и 12,8 % против 0, 20 и 17 % против 5,5 % соответственно), а также детьми с Тх (против 0 % к ВПГ, 5 % к ЦМВ и 7 % к ВЭБ соответственно). По выявляемости АТ класса М к герпесвирусам дети с Тх почкой могут быть сопоставимы со здоровыми. В 5 случаях из группы вторичных ГП одновременно выявлялись АТ класса М к двум и более герпесвирусам. Клинически у 4 пациентов с СКВ, ЛН отмечался медленный ответ на проводимое лечение.

Молекулярно-биологическое исследование (ПЦР). Кроме проведенного серологического исследования сыворотки крови пациенты всех групп были протестированы методом ПЦР на наличие ДНК ВПГ, ЦМВ, ВЭБ (табл. 2).

При ПЦР-исследовании сыворотки крови на наличие ДНК ВПГ 1-го и 2-го типа у 1 пациента (IgAN) из 2-й группы и 5 (ГВ-1, СКВ-4) из 1-й группы получены положительные результаты. У детей с Тх ДНК ВПГ выявлена не была. В контрольной группе 1 проба также оказалась положительной в отношении данного типа ДНК.

ДНК ЦМВ была обнаружена только в образце пациентки с IgAN из 2-й группы, у одного ребенка контрольной и не обнаружена ни в одной пробе детей 1-й группы. Среди Тх пациентов ДНК ЦМВ выявлена у 7 детей.

ДНК ВЭБ была найдена в 43 образцах сывороток исследуемых групп (в 18 из 1-й, в 15 из 2-й), у 5 детей с Тх почкой и в 5 образцах контрольной группы.

При сопоставлении проведенных серологических и молекулярно-биологических исследований были получены следующие данные. В исследуемых группах ДНК ВПГ 1-го и 2-го типа была обнаружена в 4 образцах детей с СКВ и 1 с ГВ. Ig класса M к ВПГ в этих сыворотках не обнаружено, однако 4 образца были серопозитивными по IgG.

НК ВЭБ обнаружили в 33 пробах детей с ГП. Ig класса M к капсидному антигену VCA ВЭБ были обнаружены двух образцах, однако еще 4 сыворотки были положительными на наличие IgG к раннему антигену ЕА ВЭБ. Все пациенты были из 1-й исследуемой группы.

Следует отметить, что в контрольной группе у одного пациента в сыворотке крови была обнаружена ДНК ЦМВ, уровень антител M к этому возбудителю находился в серой зоне (сомнительный результат), он был серопозитивным по IgG. Пациент не имел почечной патологии и клинических признаков инфекционного процесса, наблюдался по поводу вегетососудистой дистонии.

Таким образом, у 10 из 41 (24,4 %) ребенка с вторичными ГП в сыворотке крови были обнаружены как антитела к ВЭБ (IgG к раннему АГ и IgM к вирусному капсидному АГ), ЦМВ и ВПГ (IgM), так и НК ВПГ, ЦМВ и ВЭБ, что может указывать на роль герпетической инфекции в патогенезе вторичных хронических ГП.

У 8 пациентов, у которых по данным серологического тестирования выявлялись противогерпетические АТ класса М или при молекулярно-биологическом исследовании сыворотки крови детектировался специфический фрагмент ДНК ВПГ или ЦМВ, или ВЭБ дополнительно была исследована моча. Проведенный анализ показал, что у пациентки с СКВ, ЛН наряду с обнаружением IgM в сыворотке крови выявлялся фрагмент ДНК к ЦМВ в моче, что может предполагать локальное размножение герпесвирусов в органах мочеполовой системы.

Проведенный молекулярно-биологический анализ 10 нефробиоптатов показал наличие ДНК ВПГ 1-го и 2-типа в одном и ДНК ЦМВ в 2 случаях. Полученные результаты могут свидетельствовать об участии ткани почки в качестве резервирующего органа для диссеминации и возможного размножения герпесвирусов.

Электронно-микроскопическое исследование нефробиоптата. С целью изучения роли герпесвирусов в развитии ГП методом ультраструктурного анализа исследованы нефробиоптаты пациентов с ГП, у которых методом ПЦР в крови или ткани почек была обнаружена ДНК вирусов семейства Herpesviridae. Наличие этиологического агента с выявлением вирусных частиц, находящихся на ранних и конечных стадиях морфогенеза, было подтверждено только в одном из исследованных биоптатов. Чаще отмечались косвенные признаки инфекции. В клубочках визуализировались как специфические, так и неспецифические дистрофические изменения подоцитов. Кариоплазма в центральной части ядра была светлой, хроматин располагался вдоль внутреннего слоя ядерной мембраны. В дистрофически измененных клетках отмечалось исчезновение ядрышек, пери- и межхроматиновых гранул и накопление беспорядочно расположенных глыбок хроматина. Другой тип изменений наблюдался в цитоплазме инфицированных клеток. Специфические дистрофические процессы проявлялись в виде резких расширений канальцев и цистерн эндоплазматического ретикулума c накоплением электронно-плотных включений внутри. Обнаруживались светлые «пустые» вирусные частицы размером 80–90 нм и отдельные ДНК-содержащие нуклеокапсиды. Большинство вирусных капсидов содержали электронно-плотную сердцевину, что свидетельствовало о репродуктивном типе инфекционного процесса с формированием зрелых вирусных частиц (рис. 1).

Анализируя результаты ультраструктурного анализа, можно сделать вывод, что герпесвирусы оказывают влияние на развитие и течение патологического процесса в почечной ткани и могут являться этиологическими факторами в патогенезе и прогрессировании ГП. Данные ультраструктурного состояния подоцитов важны для дифференциальной диагностики и последующего выбора тактики патогенетической терапии ГП.

На основании проведенной работы разработан алгоритм вирусологического обследования детей с гломерулопатиями. Обследование осуществляется в отношении вирусов простого герпеса 1-го и 2-го типов, цитомегаловируса и вируса Эпштейна — Барр по схеме, состоящей из 3 этапов и представленной на рис. 2.

Первый этап — серологическое обследование в отношении наличия специфических противогерпетических АТ классов М и G в сыворотке крови пациентов. Положительный результат в отношении IgM говорит о текущей/недавно перенесенной инфекции и требует повторного серологического обследования через 4–5 недель. Положительный результат при повторном обследовании свидетельствует об активной герпесвирусной инфекции в организме и является показанием для 2-го этапа обследования.

Второй этап исследования включает молекулярно-биологическое исследование образцов сыворотки крови и мочи с целью обнаружения ДНК герпесвирусов. Положительный результат при исследовании крови свидетельствует о виремии, в моче — о вирурии и является показанием для комплексного исследования нефробиоптата.

Третий этап исследования заключается в комплексном исследовании нефробиоптата с помощью гистологического, иммуногистохимического, электронно-микроскопического и молекулярно-генетического методов с целью постановки дифференциального диагноза и обнаружения ДНК и/или частиц вируса in situ в подоцитах. По результатам третьего этапа осуществляется коррекция проводимой терапии с назначением этиотропных противогерпетических препаратов.

При установлении у пациента с гломерулопатией герпесвирусной инфекции, локализованной в подоцитах, необходимо привлечение врача-инфекциониста для определения тактики этиопатогенетической терапии, направленной на коррекцию герпесиндуцированных поражений почек.

Молекулярная индикация и дифференциация полиомавирусов BKV, JCV. Методом ПЦР ДНК-содержащих вирусов в режиме реального времени проведено исследование 42 сывороток крови и 21 образца мочи детей, реципиентов почечного трансплантата, на наличие полиомавирусов (в качестве группы сравнения для групп детей с первичными и вторичными ГП (n = 88)). Все дети с первичными и вторичными ГП оказались негативными по наличию частиц ПВ, в то время как после трансплантации почки у 1 пациента в сыворотке крови, у 1 в моче выявлена ДНК двух вирусов BK и JCV, у 1 в моче — ДНК ВК вируса, у 4 пациентов обнаружена ДНК JCV вируса.

Учитывая тот факт, что научные исследования по проблеме полиомавирусной инфекции (ПВИ) у детей в нашей стране до настоящего времени не проводились, целесообразным представляется дальнейшее исследование роли ПВИ в развитии нефрологической патологии у иммунокомпетентных пациентов.

Обсуждение

Исследованиями зарубежных и отечественных авторов показано, что вирусные АГ принимают участие в образовании иммунных комплексов, которые обнаруживают у пациентов с ГП. В почечных депозитах находят АГ вируса гепатита В и С, паротита, ВЭБ, ЦМВ, ВПГ, кори, аденовируса, парвовируса В19, ВИЧ и др. [2, 17–19]. Этиопатогенетическую роль вирусов доказывают с помощью иммуносерологических, иммуногисто- и цитохимических, молекулярно-биологических методов исследования с использованием различных биологических материалов, в том числе почечного биоптата [4, 20, 21].

Ассоциация гломерулярного поражения вирусами приводит к торпидному течению ГП, развитию резистентности к проводимой гормональной и цитостатической терапии, ухудшению прогноза [2–4]. В.В. Длин в своих работах доказал роль вирусов группы герпеса в этиопатогенезе ГН у детей, а также обосновал применение у таких детей противовирусной и иммунокорригирующей терапии [2, 3].

Особое место в развитии патологии почек принадлежит ВЭБ, относящемуся к группе Herpesviridae 5-го вида. Описываются наблюдения острой почечной недостаточности в связи с развитием тубулоинтерстициального нефрита [22]. Заболевание проявляется как у детей, перенесших мононуклеоз, так и у тех, у кого первичное поражение вирусной инфекцией протекало асимптомно. Имеются сведения и о возможном поражении клубочковой системы почек ВЭБ с развитием нефротического синдрома [19]. Исследуя биоптаты почечной ткани при фокально-сегментарном гломерулосклерозе, мембранозной нефропатии и IgA-нефропатии, Н. Imata et al. [5] обнаружили присутствие ВЭБ в мезангии, что, по их мнению, свидетельствует о его способности поражать гломерулярные структуры. Однако остается неясным, является ли указанная инфекция этиологическим фактором или сопутствует иммунному процессу в связи с иммуносупрессивной терапией.

Ряд авторов указывает на связь клинических и серологических параметров у пациентов с СКВ и профилем антител к ВЭБ [23–26].

В литературе обсуждают вопросы неспецифического повреждения почек в ходе противовирусного иммунного ответа, гиперактивной поликлональной гипергаммаглобулинемии при некоторых вирусных инфекциях, наличие аутоиммунного компонента в патогенезе, чрезмерной макрофагальной активации при гемофагоцитарном синдроме. Главной особенностью иммунного статуса при герпетической инфекции является формирование вторичного иммунодефицита. В иммунокомпетентном организме герпетическая инфекция приобретает бессимптомное латентное течение, однако у пациентов в состоянии иммуносупрессии при длительной ИС-терапии происходит реактивация герпетической инфекции [27–29].

Полиомавирусная инфекция человека относится к малоизвестным и недостаточно изученным вирусным заболеваниям. Данные литературы о встречаемости ПВИ среди детей с патологией почек весьма ограниченны. Известно, что тропизм ПВ направлен преимущественно на эпителий мочевой системы (МС), именно патология МС является наиболее частым клиническим проявлением ПВИ. Особенно тяжелые проблемы ВК вирусы вызывают у пациентов на фоне лекарственного подавления иммунитета, когда происходит реактивация вирусной инфекции с виремией и вирурией и развитием иногда фатальных осложнений. Особую актуальность представляет своевременная лабораторная диагностика ПВИ, направленная на оперативное выявление возбудителя и определение индивидуальной количественной оценки вирусной нагрузки с целью выработки адекватных подходов к лечению [12–14].

Несмотря на значительные успехи, достигнутые на сегодняшний день как в ранней диагностике, так и в лечении и прогнозе при СКВ с поражением почек, основной причиной смерти в детском возрасте остается развитие цитопенического синдрома и присоединение инфекции, возникающие вследствие либо недостаточности иммунной системы, которая вызвана самим заболеванием, либо агрессивной иммуносупрессивной терапии.

Выводы

Анализируя полученные результаты молекулярно-биологического исследования сывороток крови, мочи и ультраструктурного анализа нефробиоптата, можно сделать вывод, что герпесвирусы оказывают влияние на развитие и течение патологического процесса в почечной ткани и могут являться этиологическими факторами в развитии и прогрессировании ГП.

В случаях, когда причиной развития болезни или ее рецидива является вирусная инфекция, решение об отмене цитостатика должно приниматься немедленно из-за опасности быстрой генерализации инфекции и возможного неблагоприятного исхода. Необходима четкая верификация возбудителя с последующим назначением специфической антивирусной терапии.

Показано, что обнаруженные в биологическом материале специфические фрагменты НК герпесвирусов указывают на роль в поражении гемотканевого барьера, повреждении эндотелиоцитов, перицитов, подоцитов в зонах клубочкового аппарата. В результате ультраструктурного анализа пункционных биоптатов почки детей с гломерулопатиями, у которых методом ПЦР в крови или ткани почек была обнаружена ДНК вирусов семейства Herpesviridae, в цитоплазме подоцитов верифицировано наличие капсидов вируса герпеса. Полученные данные свидетельствуют, что герпесвирусы оказывают влияние на развитие и течение патологического процесса в почечной ткани и могут являться триггерами в патогенезе и прогрессировании гломерулопатий.

Разработанный алгоритм вирусологического обследования детей с гломерулопатиями с целью верификации герпесвирусной инфекции (ВПГ, ЦМВ, ВЭБ) будет полезен для практического врача-нефролога как на этапах диагностики, так и мониторинга пациента с ГП. Данные вирусологических исследований (серологических, молекулярно-биологических, электронно-микроскопических) важны для дифференциальной диагностики и последующего выбора тактики патогенетической терапии гломерулопатий. Наличие у пациента активной/реактивированной герпетической инфекции является показанием для уменьшения объема иммуносупрессивной терапии — отмены цитостатического препарата, коррекции дозы преднизолона.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии какого-либо конфликта интересов при подготовке данной статьи.

Информация о вкладе авторов в подготовку статьи: Козыро И.А. — сбор, обработка и анализ полученных материалов; Рубаник Л.В. — выполнение лабораторной части исследования; Сукало А.В. — концепция и дизайн исследования; Чеботарева Т.К. — сбор материала.