Журнал «Травма» Том 20, №5, 2019

Дана робота є фрагментом НДР «Розробка системи хірургічного лікування та реабілітації хворих з ушкодженнями ліктьового суглоба та їх наслідками» (номер державної реєстрації 0119U001024).

Вступ

Остеоартроз колінного суглоба — це дегенеративне захворювання, що включає ушкодження менісків та зміни суглобового хряща і може потребувати тотальної артропластики [1]. Проте хірургічне лікування не у всіх випадках може бути застосовано або є недостатньо ефективним. Консервативне лікування в першу чергу спрямоване на полегшення симптомів захворювання, блокування болю, запалення [2]. Внутрішньосуглобові ін’єкції кортикостероїдів забезпечують лише короткочасне поліпшення стану пацієнта [3]. Існує потреба у покращенні інвазивних методів лікування. Для цього запропоновано застосування автологічних клітинних матеріалів: тромбоцитарної плазми, мезенхімальних клітин кісткового мозку та жирової тканини. Найпростішим і рутинним методом є отримання збагаченої тромбоцитарної плазми з крові. При введенні приготованої плазми утворюється фібриновий каркас, який сприяє міграції клітин та регенерації тканин кісток і сухожилків [4, 5].

Аспірат із кісткового мозку є доступним джерелом мезенхімальних стовбурових клітин [6], однак кількість таких клітин у аспіраті менше 0,01 %, тому запропоновано вводити концентрат аспірату [7]. Вважається, що позитивні результати лікування після введення концентрату кісткового мозку пов’язані із здатністю мезенхімальних клітин виділяти фактори росту (PDGF, TGF–b) і активувати відновні процеси [8]. Як просту в одержанні альтернативу розглядають мезенхімальні клітини з жирової тканини. Однак вони є морфогенетично стійкішими порівняно з клітинами, які було одержано з кісткового мозку [9]. Кожен із підходів запропоновано для лікування остеартрозу, і навіть отримано деякі позитивні результати, проте порівняння їх дії, наслідків введення та структурних основ відновних процесів не описане [10, 11].

Мета роботи: дослідити структурні зміни менісків та епіфіза ушкодженої остеоартрозом великогомілкової кістки після застосування клітинних технологій.

Матеріали та методи

Експерименти проведено на 24 кролях лінії шиншила вагою 3–4 кг. В експерименті тварин розподілили на 5 дослідних груп: контроль — інтактні тварини (n = 4); група 1 — артроз (n = 5); група 2 — артроз + тромбоцитарна плазма (n = 5); група 3 — артроз + аспірат кісткового мозку (n = 5); група 4 — артроз + аспірат жирової тканини (n = 5).

Модель остеоартрозу полягала у механічному ушкодженні суглобової поверхні великогомілкової кістки, перетині великогомілкової зв’язки і коагуляції судин капсули. Модель характеризується прогресуючим розвитком дегенеративних змін гіалінового хряща і резорбції субхондральної кісткової тканини епіфіза кістки, змінами мікроциркуляції суглобової капсули меніска суглоба [12]. Через місяць після операції у дослідних групах 2, 3 і 4 у порожнину колінного суглоба вводили розроблені (запропоновані) суспензії клітинних технологій.

Методика отримання тромбоцитарної плазми. Збагачену тромбоцитами плазму отримували з донорської венозної крові. Забір донорської крові проведено у ДУ «ІТО НАМН України» відповідно до ліцензії Міністерства охорони здоров’я України. Венозну кров здорових осіб збирали у стерильні пластикові пробірки об’ємом 10 мл (кожна містила антикоагулянт — 3,8% цитрат натрію) та центрифугували при 400 g упродовж 15 хвилин (t = 4 °С), як це описано у стандартному протоколі [13]. Для введення здійснювали забір шару тромбоцитарної плазми над еритроцитарною масою. Концентрація тромбоцитів — 0,8–1 • 10⁶ 1/мл. Об’єм введення у суглоб — 0,5 мл.

Методика отримання кісткового аспірату. Кістковим троакаром діаметром 10 G та шприцом 5 мл із проксимального відділу стегна кролика виконували аспірацію автологічного кісткового мозку в об’ємі 2 мл. Аспірат кісткового мозку з цитратом декстрози (1 : 8) АЦД–А (Бакстер С.А., США/Бельгія) центрифугували 16 хвилин при 740 g та здійснювали забір 1,0 мл надеритроцитарної фракції. Клітинний концентрат уводили у синовіальну порожнину колінного суглоба.

Методика отримання аспірату жирової тканини. У кроликів здійснювали забір 1 мл автологічної жирової клітковини з великого сальника через 1 см доступ до черевної порожнини, після чого забрану жирову тканину подрібнювали та гомогенізували шляхом 10–кратного пропускання через 1–мм канюлю. Об’єм уведення у суглоб становив 0,5 мл.

Через 2,5 місяця після моделювання остеоартрозу тварин виводили з експерименту шляхом швидкої декапітації. Колінний суглоб було виділено для гістологічного дослідження. Зразки фіксували у 10% розчині нейтрального формаліну. Після фіксації виділяли епіфіз великогомілкової кістки, дистальний епіфіз стегнової кістки, капсулу і меніск суглоба. Фрагменти кісток демінералізували у розчині OsteoFast 2 (BioGnost Ltd., Хорватія). Після відмивання усі зразки заливали у парафін (Leica Surgipath Paraplast Regular) за стандартною методикою. Парафінові зрізи забарвлювали гематоксиліном з еозином, толуїдиновим синім та досліджували на мікроскопі Olympus BX 51.

Структурні зміни колінного суглоба оцінювали за шкалою, що описано у публікації J. Fitzgerald (2008), та морфометрично [14]. Згідно з градацією шкали на кожен досліджений зразок присвоювали бал за такими критеріями: зміни клітинної морфології хряща (0–4 бали), рівень забарвлення матриксу хряща (0–3), регулярність поверхні (0–3), товщина хряща (0–2) та інтеграція з нативним хрящем (0–2). Максимальна кількість балів за шкалою — 14, мінімальна — 0, що відповідає повній деструкції хрящової поверхні епіфіза кістки. Досвід застосування шкали
J. Fitzgerald щодо оцінки прогресуючих змін у суглобі описано у публікації [15]. Морфометрична оцінка полягала у вимірюванні товщини перифокального хряща у сагітальній проекції епіфіза великогомілкової кістки та вимірюванні відносної щільності епіфізарної кісткової тканини. Кількісні вимірювання проведено за допомогою програмного забезпечення Carl Zeiss (AxioVision SE64 Rel.4.9.1). Міжгрупову різницю оцінювали за непараметричним критерієм Краскела — Уолліса у програмі Origin Labversion 8.0. Дані подано у вигляді медіани з меншим та більшим квартилем (M [Q1–Q3]). Різницю вважали статистично вірогідною при P < 0,05.

Результати та обговорення

Макроскопічні зміни

Через 2,5 місяця після моделювання остеоартрозу проведено комплексний аналіз структурних утворень колінного суглоба — капсула суглоба, меніски, епіфізарний хрящ великогомілкової кістки, зокрема субхондральна кісткова тканина. При макроскопічному дослідження капсула суглоба була візуально збільшеною, пружною, з новоутвореними судинами. При розрізі капсули у зразках із запаленням реєстрували вихід ексудативної рідини. У деяких зразках груп 3 і 4 виявлено збільшення ніжної сполучної тканини з внутрішньої поверхні капсули. У табл. 1 наведено результати кількісної оцінки морфологічних змін суглоба з урахуванням гістологічних змін епіфізарного хряща. В усіх досліджених зразках встановлено деформаційні зміни суглобової поверхні епіфіза, зокрема повну деструкцію й оголення епіфізарної поверхні великогомілкової кістки в 1 зразку групи 3. Статистично значущої різниці між групами порівняння за шкалою J. Fitzgerald не встановлено, виявлено тенденцію до зменшення ушкодження матриксу хряща у групах 2 і 4. Далі проведено комплексний аналіз морфологічних змін меніска і суглобового хряща великогомілкової кістки.

Структурні зміни менісків суглоба

Меніски колінного суглоба було виділено в усіх дослідних тварин груп 1–4. На макроскопічному рівні відзначено дегенеративні зміни: зменшення товщини меніска, порушення фіксації, набряк сполучної тканини на рівні передніх і задніх рогів меніска (рис. 1). Аналіз гістопрепаратів ушкоджених менісків дозволив визначити основні структурні зміни. Так, ушкодження домінували з внутрішньої поверхні латерального і медіального меніска, відзначено фрагментарне ушкодження після моделювання патології. Верхня, нижня і латеральна поверхні тіла менісків більшою мірою були структурно збережені. Тіло менісків через 2,5 місяця після моделювання остеоартрозу все ще зберігало матрикс гіалінового хряща, але у зразках групи 1 і зразках груп 3 і 4 із морфологічно підтвердженим запальним інфільтратом виявлено набряк клітинних лакун, редукцію щільності хондроцитів у тілі меніска, появу порожніх лакун, а при тотальному ушкодженні епіфізарного хряща запалення поєднувалось з геморагічним просоченням (рис. 2а).

У цілому в дослідних групах 2–4 відзначено дещо кращий ступінь збереження структури тіла менісків і деякі ознаки дії клітинних аспіратів на відновний процес (рис. 2б–г). Так, у групі 2 виявлено ділянки проліферації клітин синовіальної оболонки, що вказує на регенерацію під дією тромбоцитарною плазми (рис. 3б). У групі 3 із внутрішньої і нижньої поверхонь меніска і з поверхні синовіальної оболонки встановлено новоутворену ретикулярну тканину, що, ймовірно, походить з аспірату кісткового мозку, який було введено через 1,5 місяця після ушкодження (рис. 3в). На рівні рогів меніска відзначено проліферативні зміни у сполучній тканині й ознаки ангіогенезу. У групі 4 також встановлено наслідки введення аспірату жирової тканини (рис. 3г). Із внутрішньої поверхні меніска встановлено збільшення пухкої сполучної тканини і появу осередків адипоцитів. Важливо зазначити, що аспірат кісткового мозку і жирової тканини заповнювали проміжок між меніском і суглобовою поверхнею, а також морфологічно поєднувались з синовіальною оболонкою. Відбувалась інтеграція клітин внесених аспіратів з оболонкою меніска і капсулою, що можна розглядати як прояв регенеративних процесів.

Структурні зміни суглобового хряща великогомілкової кістки

На гістологічному рівні досліджено епіфізарний хрящ і субхондральну кісткову тканину. Епіцентр механічного ушкодження був позбавлений хряща, а перифокальна поверхня характеризувалась зменшенням товщини. Дистрофічні зміни призвели до зменшення щільності ізогенних груп хондроцитів у хрящі, появи порожніх мікролакун, зменшення забарвлення хондромукоїда (рис. 4). Зміни встановлено як у поверхневих, так і у глибоких шарах хряща. Перші, ймовірно, пов’язані з деформаційним ушкодженням, а другі виникли через реорганізацію субепіфізарної кістки. Поява порожніх лакун або лакун із судинами вказувала на розвиток остеоартрозу.

Зміни у субхондральній кістці полягали у зменшенні щільності кісткових трабекул, появі порожніх лакун, що є свідченням як резорбції, так і посттравматичної деформації. У зразках із вираженим запальним інфільтратом щільність кісткового мозку була зменшеною (до 20 % порівняно з 66,1 % у контролі) і частково заміщена фіброзною тканиною. Різницю між групами порівняння встановлено морфометрично. У табл. 2 наведено результати морфометричних досліджень епіфіза великогомілкової кістки. У всіх дослідних групах мало місце зменшення товщини гіалінового хряща у перифокальній зоні, тобто відбувалось прогресуюче збільшення епіцентру ушкодження. При цьому щільність субхондральної кісткової тканини вірогідно зменшилась у 1,7 раза (Р < 0,05). Комплексний аналіз показників у групах 2–4 засвідчив пригнічення (запобігання) розвитку дистрофічних змін у хрящі та кістковій тканині після введення тромбоцитарної плазми і лише часткове запобігання ушкодженню кісткової тканини після введення аспірату кісткового мозку. Введення аспірату жирової тканини не викликало прогресування структурних порушень (можна розглядати лише як тенденцію до позитивної дії на рівні щільності кісткової тканини епіфіза великогомілкової кістки).

Отже, на основі комплексного аналізу структурних змін у капсулі колінного суглоба, менісків, стану синовіальної порожнини, епіфіза ушкодженої остеоартрозом великогомілкової кістки зроблено заключення про позитивний вплив введення у синовіальну порожнину автологічних клітинних препаратів з метою запобігання прогресуючим деструктивним порушенням. Дія тромбоцитарної плазми, аспірату кісткового мозку і жирової тканини пов’язана з відновлюючим впливом на синовіальну оболонку і меніски колінного суглоба, що ймовірно сприяє затримці або запобіганню прогресуючому ушкодженню епіфізарного хряща колінного суглоба.

Висновки

1. Введення тромбоцитарної плазми та автологічних аспіратів позитивно позначилось на збереженні морфології менісків. Через 1,5 місяця після введення автологічних аспіратів відбувається інтеграція введених клітин із синовіальною оболонкою та меніском: розвиток ретикулярної тканини у групі з аспіратом кісткового мозку, формування ніжної сполучної тканини з адипоцитами у групі з аспіратом жирової тканини.

2. Реорганізація і часткова інтеграція автологічних тканин у синовіальній порожнині є свідченням їх життєздатності та потенційної регенерації, на що вказує ангіогенез.

3. Деформаційне ушкодження великогомілкової кістки спричинило прогресуючі зміни на рівні суглобового хряща і субхондральної кістки, але пригнічення розвитку структурних змін у кістці відбувалось у хрящі при застосуванні тромбоцитарної плазми й аспірату кісткової тканини, а дистрофічних змін хряща — лише після введення плазми.

Конфлікт інтересів. Автори заявляють про відсутність конфлікту інтересів та власної фінансової зацікавленості при підготовці даної статті.