Газета «Новости медицины и фармации» 9(244) 2008

Последнее десятилетие уходящего века было объявлено Всемирной организацией здравоохранения «десятилетием мозга», и это не случайно. Церебральная патология по распространенности занимает третье место среди населения стран Европейского Союза и Американского континента, уступая лишь заболеваниям сердечно-сосудистой системы и злокачественным новообразованиям. Заболевания головного мозга деструктивного и дегенеративного характера приводят не только к уменьшению продолжительности жизни населения, но и ограничивают социальную активность человека в силу развития когнитивного дефицита, снижая способность индивидуума к мышлению, обучению, адекватному восприятию информации и принятию решений. Список церебральных нарушений, сопровождающихся когнитивной дисфункцией, достаточно велик и включает в себя травму мозга, хроническую цереброваскулярную недостаточность, постгипоксическую энцефалопатию, нейроинфекции, хронический алкоголизм, задержку развития у детей, поражения мозга нейродегенеративного характера [10, 18]. Нарушение когнитивных и ассоциативных функций в условиях церебральной патологии протекает на фоне выраженных структурных изменений тканей мозга за счет угнетения процессов биоэнергетики; развитие глутаматной эксайтотоксичности, гиперпродукции активных форм кислорода, снижение активности антиоксидантных систем приводят в итоге к развитию апоптоза. Именно активация апоптоза, по мнению многих исследователей, является первопричиной развития стойких нарушений когнитивно-мнестических функций ЦНС [6, 9, 32, 36].

Биохимические и морфоцитологические признаки апоптоза выявляются в большом спектре экспериментальных нейродегенеративных расстройств: транзиторной церебральной ишемии, вызванной окклюзией церебральной артерии; интрацеребральной геморрагии; на моделях эпилептогенных судорог; локальном термическом повреждении мозга. Апоптоз имеет место при любых проявлениях ишемических и травматических повреждений нервной ткани, включая нарушения спинного мозга, деменциальные изменения, связанные с развитием болезней Альцгеймера, Паркинсона, сенильной деменцией, врожденной патологии мозга и др. Таким образом, можно говорить о нейроапоптозе как новом патобиохимическом механизме нейродегенеративных расстройств широкого спектра [8, 9, 14, 42].

Основное для понимания апоптоза как принципиально нового морфо- биохимического процесса, отличного от некроза, — включение специализированных биохимических механизмов, в результате которых происходит разрыв молекулы ДНК и уничтожение белоксинтезирующих структур [22, 25].

Регуляция апоптоза в нервной системе осуществляется многочисленными сигнальными системами. Причем пути реализации этого процесса могут быть различными: нарушение энергетического потенциала митохондрий, образование активных форм кислорода (АФК), модуляция факторов транскрипции (p53, AP-1, NF-kB), прямая активация генов раннего реагирования (c-jun, c-fos) [11, 46].

В настоящее время выделены три фазы апоптоза:

1. Инициация (индукция).

2. Эффекторная фаза.

3. Фаза деградации.

В качестве инициирующих апоптоз факторов могут выступать: избыток глутамата, депривация ростовых факторов, свободнорадикальное окисление, гипогликемия. Первичная реакция со стороны нервной клетки на апоптическое воздействие, по-видимому, реализуется генами раннего реагирования. Активация этих генов рассматривается как один из основных сохранившихся в эволюции компонентов нейронального ответа на повреждение [11, 12, 14]. Протеины генов раннего реагирования — c-jun, c-fos — образуют димеры с другими белками — D-Jim, ATF (активизирующий фактор транскрипции), в результате чего образуется комплекс AP-1. При этом механизм активации апоптоза генами раннего реагирования c-jun, c-fos, а также их продуктом — фактором транскрипции AP-1, по-видимому, обусловлен либо синтезом патологических белков, либо индукцией образования гипотетического апоптического фактора. Активация генов немедленного реагирования в нейроне может осуществляться через протеинкиназный каскад p 21 ras — MAPK или сфингомиелиназоцерамидный сигнальный путь. В результате повышается транскрипция этих генов, что способствует развитию апоптоза [24, 26].

Среди факторов запуска апоптоза следует отметить образование АФК как «извращенный» путь окислительного метаболизма в клетке. Считается, что повреждения, развивающиеся в результате аноксии или ишемии ткани любого уровня, обязаны в первую очередь образованию АФК. Первичным источником АФК оказываются митохондрии, которые играют ключевую роль в энергетическом обеспечении клетки. Ныне существует обобщенное клиническое понятие «митохондриальная патология»: повреждение мембран митохондрий ведет к образованию супероксидных радикалов, которые, реагируя с NO, образуют пероксинитриты, повреждающие молекулы АФК [3, 5, 23, 29, 33].

В точных биохимических исследованиях было установлено, что нарушение «нормальной» аккумуляции Са²⁺ митохондриями, высвобождение апоптогенных белков из поврежденных митохондрий в цитозоль служат механизмами, ответственными за индукцию апоптоза. В этом контексте существенна роль одного из нейротрофических факторов — фактора некроза опухоли (TNF), с которым связаны открытие пор в митохондриях, последующий разрыв их мембраны и высвобождение проапоптических белков в цитозоль клетки. В настоящее время выделяют следующие факторы, последовательно включающиеся в апоптоз:

1. Гиперпродукция эксайтоксических (excitoxic — возбуждающие) аминокислот и длительная активация глутаматных рецепторов, выраженные при нарушении функции нервных клеток вследствие возрастных нейродеструктивных процессов, болезни Альцгеймера, паркинсонизма, при остром нарушении мозгового кровообращения.

2. Образование АФК, которое стимулирует синтез провоспалительных цитокинов, включающихся в каскад апоптических процессов.

3. Гиперэкспрессия генов раннего реагирования c-fos, c-jun.

4. Экспрессия группы рецепторов и проапоптических белков (FAS, APO-1 p53 и др.). Один из наиболее значимых в этой группе — белок p53.

5. Включение каскада протеолитических реакций, приводящих к расщеплению белков ядерного матрикса, дестабилизации структуры хроматина ядер, фрагментации ДНК, нарушению репликационной и метаболической функций клетки. Среди ферментов, причастных к разветвлению цепи апоптоза, ведущее место принадлежит каспазам, относящимся к семейству 1-интерлейкин-конвертирующих протеаз.

6. Участие специфических регуляторных белков, препятствующих реализации апоптозной программы. Один из них — белок bcl-2 оказывает защитное действие на многие типы клеток, пребывающие в неблагоприятных условиях. В исследованиях in vitro для оценки апоптоза используется отношение белков bcl-2/Bax; избыток первого способствует выживанию клетки, избыток второго — ее гибели. Предпологают, что антиапоптическое действие bcl-2 связано с нормализацией функции митохондрий, котрые учавствуют в реализации апоптоза. Конкретными механизмами этого процесса являются: 1) блокирование высвобождения из митохондрий цитохрома C; 2) участие bcl-белков в формировании трансмембранных митохондриальных пор, что определяет трансмембранный потенциал, а также высвобождение различных активных соединений и ионов из митохондрий; 3) возможность проникновения этих белков в липидные структуры мембран и формирование ионных каналов, что имеет значение в субклеточном распределении Ca²⁺ между ядром, митохондриями и эндоплазматическим ретикулумом [11, 16, 34, 35, 47].

Баланс про- и антиапоптических механизмов связан с оксидом азота (NO), различные пути образования которого могут определять как цитотоксическое, так и цитопротекторное его действие. Длительная генерация NO, опосредуемая гиперэкспрессией гена c-fos, провоцирует развитие апоптоза: усиливается синтез белка р53 и активируются протеазы из семейства каспаз. Следует отметить, что каспазы, расщепляя как ядерные, так и цитоплазматические белковые структуры нейрона, учавствуют не только в эффекторной стадии, но и в фазе деградации апоптоза, выступая в качестве основного повреждающего фактора в этом процессе [5, 6, 17]. Принято считать, что каскад апоптозных процессов может быть спровоцирован либо прямым действием на геном клетки (АФК, ONOO^-), либо через нейромедиаторы (глутамат), либо причинами, связанными с ишемией клетки, ее физическим повреждением, реперфузией, токсическим воздействием [7, 17, 47]. Биохимические процессы, сопровождающие апоптоз, проявляются экспрессией специфических генов и синтезом особых белков клетки, запускающих реакции апоптоза. Подобная полиэтиологичность предопределяет инициацию апоптоза при многих патологических состояниях как всего организма, так и отдельных его органов или клеточных популяций [60].

Биохимические и цитоморфологические исследования апоптоза выявляют несколько стадий его развития в поврежденной нервной ткани: непосредственную и отсроченную. Как правило, исходное повреждение ткани не ограничивается областью воздействия разрушающей силы, а продолжаясь во времени, захватывает первично интактные клетки и приводит к расширению очага повреждения [60].

Экспериментальными работами последнего десятилетия показана значительная роль гиперэкспрессии генов раннего реагирования c-fos в развитии апоптоза нейрональных клеток при нейродеструктивных заболеваниях. Так, в условиях гиперпродукции АФК нейрохимическими и биоэнергетическими системами головного мозга, в условиях ишемии головного мозга, а также при ряде других нейродеструктивных заболеваний происходит активация экспрессии редоксчувствительных генов, многие из которых необходимы для защиты клеток от токсических эффектов окислительного стресса [9, 33, 60]. Так, при нормальной концентрации кислорода в окружающей клетку среде (нормоксия) под действием АФК происходит в основном активация JunB, ATF-2- факторов транскрипции, а в условиях окислительного стресса — преимущественно факторов c-jun и c-fos. Активация именно этих факторов транскрипции в условиях гиперпродукции АФК объясняется тем, что JunB и c-fos содержат в своих ДНК-связывающих доменах высокочувствительные к АФК остатки цистеина — Cys252, Cys154, Cys61. Окисление их SH-групп приводит к обратной инактивации АР-1 и NF-kB. Помимо этого, белок c-fos непосредственно участвует в процессе фрагментации ДНК и инициировании процессов апоптической гибели клетки [6, 11, 46, 47].

Кроме того, рядом работ показано, что существенную роль в гиперпродукции NO при нейродеструктивных заболеваниях принадлежит индуцибельной NO-синтазе, которая экспрессируется под действием генов немедленного реагирования — c-fos, JunB и фактора транскрипции АР-1 [5, 6, 12, 23, 59].

C-fos был одним из первых генов, для продукта которого было показано участие в регуляции транскрипции. Этот ядерный ген представляет собой одну из основных ядерных мишеней для передачи сигналов регуляции клеточного роста и трансформации, он вовлечен во множество клеточных функций, в том числе в процессы клеточной пролиферации и дифференцировки [40, 48, 49].

Ген раннего реагирования c-fos быстро, однако временно активируется в ответ на воздействия самого широкого спектра. Он находится под контролем множественных сигналпередающих систем. Так, при действии разнообразных факторов, приводящих к активации клеточной пролиферации или дифференцировки, максимум экспрессии гена c-fos наблюдается обычно через 30–45 мин после воздействия. Промотор гена c-fos обладает сложной организацией, обусловливая необходимые функциональные свойства этого гена, связанные с клеточной дифференцировкой и пролиферацией, а также с целым рядом стрессовых реакций. При взаимодействии внешних факторов с клеточной поверхностью специфично активируются внутриклеточные процессы, приводящие к взаимодействию определенных транскрипционных факторов с промотором гена c-fos. В зависимости от характера воздействия может активироваться большой набор путей передачи сигнала, центральную роль в которых играют как мембранные компоненты (рецепторы, G-белки и Ras-белки, адаптерные белки, тирозинспецифичные протеинкиназы), так и цитоплазматические протеинкиназы (РКС, РКА, компоненты МАР-киназного каскада). Несмотря на линейный характер многих путей передачи сигнала, многие их компоненты взаимодействуют с сопутствующими факторами, что усложняет сигналпередающую сеть и в то же время обогащает возможности тонкой регуляции гена c-fos [50, 51].

Анализ промоторной области гена c-fos показал ее сложную организацию. В этом регионе находятся многочисленные взаимозависимые регуляторные элементы, ответственные за индукцию c-fos и базальный уровень его экспрессии (рис. 1) [41].

В состав промотора c-fos входят несколько сайтов, связывающих неидентифицированные факторы. Эти сайты названы FBS 1–6 (fos promotor binding site 1–6), и первый из них (FBS-1) расположен в позиции –499/–508 п.н. от точки начала транскрипции. С элементом FBS-2 взаимодействует неизвестный белок с молекулярной массой 59 кДа, и это взаимодействие коррелирует с митотической активностью клеток [57, 58].

Помимо элементов, определяющих (в большинстве случаев) индукцию гена c-fos, некоторые промоторные элементы служат для связывания факторов, подавляющих транскрипцию. Один из таких элементов — RCE (retinoblastoma control element), связывающий продукт гена восприимчивости к ретинобластоме — белок Rb. Кроме того, элементы SRE и CRE в определенных физиологических условиях также определяют угнетение транскрипции c-fos гена.

Таким образом, в связи с большим количеством путей, активирующих ген c-fos, его промоторная область обладает сложной организацией. При этом некоторые промоторные элементы c-fos гена находятся под контролем как РКС-зависимых путей, так и cAMP-зависимых путей. Поэтому на уровне промотора гена c-fos и осуществляется взаимодействие этих сигнальных путей [52, 54].

Помимо участия в процессах апоптической гибели нейронов, гену c-fos принадлежит важная роль и в физиологических функциях организма. Так, Анохин и соавторы установили, что данный ген идеально подходит на роль универсального зонда для картирования мозга. Ген c-fos обладает рядом уникальных свойств. Во-первых, в спокойном состоянии клетки он «молчит», у него практически нет «фонового» уровня активности. Во-вторых, если в клетке начинаются какие-либо новые информационные процессы, он очень быстро откликается на них, нарабатывая РНК и белки. В-третьих, он универсален, то есть активируется в самых разных отделах центральной нервной системы — от спинного мозга до коры. В-четвертых, его активация связана с обучением, то есть с формированием индивидуального опыта. Многочисленные экспериментальные исследования показали, что ген c-fos не реагирует на очень сильную стимуляцию, например световую, звуковую или болевую, в тех случаях, когда воздействие не несет в себе элементов новизны. Но как только ситуация обогащается новой информацией, ген «просыпается» [2, 55]. На системном уровне активность генов в мозге при обучении переходит под когнитивный контроль. Так, в эксперименте мышей помещали в камеру, где им пришлось перенести серию слабых электрокожных раздражений. В ответ на это в нескольких областях мозга — в коре, гиппокампе и мозжечке бурно экспрессировался c-fos. Однако если эту процедуру проводить ежедневно, то на шестой день ген уже не отвечает, мыши по-прежнему реагируют на удар током, но он для них становится уже не новым, а ожидаемым событием. Можно вновь вызвать активацию c-fos, если в очередной раз поместить мышей в камеру и не подвергать их уже привычной процедуре. И в том и в другом случае ген отмечает событие, когда внешние стимулы не согласуются с матрицей индивидуальной памяти. Такое рассогласование происходит при любом усвоении новой информации, и поэтому ген c-fos — неизбежный спутник познавательных процессов в мозге [1]. Исследования M. Erdtmanna-Vourliotis и соавторов показали усиление экспрессии гена c-fos при наркотизации крыс. Так, при повторном введении морфина увеличивалась экспрессия c-fos в стриатуме, прилежащем ядре, зрительном бугорке, в цингулярной, периформной, фронтальной коре и других структурах головного мозга крыс линии Вистар. Кроме того, исследователи отметили резкое усиление экспрессии гена c-fos на протяжении нескольких дней после прекращения наркотизации [43, 44].

Подобная динамика изменения экспрессии гена была отмечена нами в экспериментах при моделировании алкоголизма у крыс. Исследования экспрессии c-fos на 3-и сутки введения 40% этанола животным показали статистически достоверное по отношению к интактным животным усиление экспрессии гена в зоне CA₁ гиппокампа (зона, отвечающая за такие интегративные функции головного мозга, как обучение, мышление, память) (рис. 2). Обучение интактных животных и животных, подвергшихся насильственной 30-суточной алкоголизации, в двухкамерной челночной системе для выработки у них условной реакции пассивного избегания (УРПИ) показало снижение экспрессии гена на фоне угнетения УРПИ и существенное повышение числа с-fos-позитивных нейронов в зоне CA₁ гиппокампа в интактной группе животных, подвергшихся обучению (рис. 3). Важно отметить, что у животных с месячной насильственной алкоголизацией в тесте УРПИ показано наличие стойкого когнитивного дефицита, что выражалось в снижении латентного времени захода животных в темный отсек. Можно предположить, что в механизме развития когнитивного дефицита у алкоголизированных крыс существенная роль принадлежит подавлению экспрессии гена раннего реагирования c-fos, что связано с его транскрипционной ролью в синтезе регуляторных белков, участвующих в механизме консолидации памяти [33, 44, 52]. Данное предположение подтверждается и опытами других исследователей, в которых показано, что подавление трансляции мРНК c-fos в структурах мозга нарушает кратковременную память на различных моделях обучения у разных видов животных [46, 55].

Таким образом, представленные выше экспериментальные исследования позволяют сделать предположение, что ген c-fos является тем самым «мостиком», через который индивидуальный опыт животного вступает во взаимодействие со всем генетическим аппаратом.

Однако не всегда усиление экспрессии гена c-fos выполняет физиологическую функцию. В случае когда экспрессия гена усиливается более чем в 20 раз, c-fos уже играет отрицательную роль. Гиперэкспрессия гена c-fos, как было отмечено выше, приводит к значительному повышению в клетке содержания белка c-fos, который непосредственно участвует в процессе фрагментации ДНК и инициировании процессов апоптической гибели клетки [6, 56, 59].

Наглядным примером отрицательной роли гиперэкспрессии c-fos может служить исследованная нами экспрессия гена c-fos при моделировании хронического иммобилизационного стресса. Проведенные исследования показали, что число с-fos-позитивных нейронов в зоне CA₁ гиппокампа у крыс с хроническим стрессом превышало более чем в 50 раз количество с-fos- позитивных нейронов интактной группы. Параллельно с гиперэкспрессией гена c-fos в данной зоне гиппокампа нами было отмечено увеличение числа апоптически и деструктивно измененных нейронов более чем на 60 % по отношению к интакту. По нашему мнению, гиперэкспрессия c-fos в условиях хронического стресса обусловлена гиперпродукцией АФК в тканях головного мозга. Известно, что в условиях окислительного стресса одной из первых реакций генома является индукция гиперэкспрессии генов немедленного реагирования c-fos за счет содержания в своих ДНК-связывающих доменах высокочувствительных к АФК остатков цистеина Cys252, Cys154, Cys61 [6].

Нашими экспериментальными работами также была изучена экспрессия гена c-fos в условиях моделирования ишемии головного мозга. Как показали исследования, экспрессия гена при данной модели патологии носила разнонаправленный характер.

Так, в условиях острой ишемии головного мозга (необратимая билатеральная окклюзия общих сонных артерий) показано увеличение содержания белка с-fos в первые 1–2 часа после начала ишемии и в течение 24 часов (увеличение c-fos-позитивных клеток в 4–5-м слое сенсомоторной зоны коры в 10–15 раз) и максимальное снижением белка c-fos к 4-м суткам (снижение c-fos-позитивных клеток в 3,6 раза). Начиная с 7-х суток экспериментальной ишемии наблюдается постепенное восстановление количества c-fos в нейронах 4–5-го слоя сенсомоторной зоны коры с максимальным проявлением активности на 21-е сутки. Однако и на 21-е сутки ишемии содержание c-fos остается низким и не достигает уровня первых часов после окклюзии. Изменение содержания c-fos в нейронах в разные сроки ишемии, с нашей точки зрения, тесно связано с преобладанием типа гибели клеток. Так, увеличение содержания c-fos происходило на фоне преобладания гибели клеток по типу апоптоза, а снижение — к усилению гибели по типу некроза. В восстановительный период происходит адаптация клетки и переключение гибели с пути некроза на апоптоз и снижение последнего [4].

Исходя из вышеизложенного, можно сделать вывод, что активация гена c-fos происходит при любых воздействиях на клетку. Характер экспрессии гена будет определять дальнейшую судьбу клетки: либо в ней будут активироваться трансляционные, транскрипционные процессы, синтез пластических материалов, либо она апоптически погибнет (гиперэкспрессия). Таким образом, учитывая чрезвычайно важную роль экспрессии гена c-fos в физиологических и патологических процессах, актуальной задачей экспериментальной медицины является поиск путей фармакологической коррекции различных патологический состояний, который будет направлен на коррекцию гипер- либо недостаточной экспрессии гена c-fos.

В последнее время активно ведется поиск высокоэффективных нейропротекторов среди нейропептидов. Новым направлением в исследовании нейропептидов стало определение их роли в регуляции апоптоза, а также их влияния на экспрессию генов раннего реагирования. Наряду с данными, свидетельствующими об участии вазоактивного пептида эндотелина-1 и его рецепторов (ЕТА) в ишемической патологии мозга, получена информация об антиапоптической активности этого пептида. На ряде моделей нейроапоптоза было также продемонстрировано защитное действие кальцитонинового нейропептида (CGRP) и пептидного фрагмента ангиотензина IV. В то же время было установлено, что сам ангиотензин II так же, как и пептид кальцийнейрин, напротив, способствует индукции проапоптического каскада. Эти факты, демонстрирующие значимость нейропептидов и ростовых факторов в нормальной и патологической деятельности мозга, отражают организацию поливариантной системы химической регуляции, обеспечивающей как жизнеспособность и защиту нейронов от неблагоприятных влияний, так и программируемую гибель определенной части клеточной популяции в случае повреждения мозга [13]. Открытие нейротрофических пептидных факторов побудило к формированию новой стратегии фармакотерапии — пептидергической, или нейротрофической, терапии нейродегенеративных патологий. Исходная идеология связывает нейродегенеративные патологии, включая болезнь Альцгеймера, с активностью различных нейротрофических факторов мозга и нейропептидов. На этой основе был разработан ряд препаратов, успешно применяемых в терапии большого спектра неврологических расстройств. Наибольший успех здесь выпал на долю Цереброкурина, кортексина, семакса, которые в течение последнего десятка лет успешно используются в клинике неврологических и психиатрических заболеваний. Нейропептиды свободно проникают через гематоэнцефалический барьер и оказывают многостороннее действие на ЦНС, что сопровождается высокой эффективностью и выраженной направленностью действия при условии их очень малой концентрации в организме [20]. Тесная взаимосвязь всех отдаленных последствий ишемии, а также общность их триггерных механизмов позволяют наряду с локальным воздействием на них использовать модулирующие влияния через системы регуляторов, осуществляющих контроль за экспрессией вторичных клеточных мессенджеров, цитокинов и других сигнальных молекул, а также за запуском генетических программ апоптоза, антиапоптозной защиты, усиления нейротрофического обеспечения. Такие регуляторные (модуляторные) влияния устраняют общую дезинтеграцию во взаимодействии сложных и часто разнонаправленных молекулярно-биохимических механизмов, восстанавливая их нормальный баланс. Особо важную роль играют эндогенные регуляторы функций ЦНС — нейропептиды [30]. Их молекулы, представляющие собой короткие аминокислотные цепи, «нарезаются» из более крупных белковых молекул-предшественников ферментами протеолиза («процессинг») лишь «в нужном месте и в нужное время» в зависимости от потребностей организма. Нейропептиды существуют всего несколько секунд, но длительность их действия может измеряться часами. Эндогенное образование нейропептида в ответ на какое-либо изменение внутренней среды приводит к высвобождению ряда других пептидов, для которых первый является индуктором. Если их совместное действие однонаправлено, эффект будет суммированным и продолжительным. Выход пептида может регулироваться несколькими регуляторными пептидами предыдущего каскада. Таким образом, эффекторная последовательность совокупности пептидов образует так называемый пептидный регуляторный континуум, особенность которого заключается в том, что каждый из регуляторных пептидов способен индуцировать или ингибировать выход ряда других пептидов. В результате первичные эффекты того или иного пептида могут развиваться во времени в виде цепных и каскадных процессов [39].

Особенностью структуры нейропептидов является наличие нескольких лигандных групп связывания, предназначенных для разных клеточных рецепторов. Это одно из «молекулярных» объяснений присущей им полифункциональности. Физиологическая активность нейропептидов во много раз превышает аналогичное действие непептидных соединений. В зависимости от места их высвобождения нейропептиды могут осуществлять медиаторную функцию (передачу сигнала от одной клетки к другой); модулировать реактивность определенных групп нейронов; стимулировать или тормозить выброс гормонов; регулировать тканевой метаболизм или выполнять функцию эффекторных физиологически активных агентов (вазомоторная, Na⁺-уретическая и другие виды регуляции). Известно, что нейропептиды способны регулировать активность про- и противовоспалительных цитокинов через модуляцию активности их рецепторов. При этом восстановление нормального баланса цитокинов происходит более эффективно, чем при воздействии на отдельные цитокиновые системы. Как правило, цитокиновые эффекты нейропептидов сопровождаются их влиянием на генерацию оксида азота и другие оксидантные процессы [5, 19, 30]. Многие нейропептиды проявляют выраженные нейротрофические ростовые свойства, а также проявляют способность регулировать экспрессию ранних генов. С учетом того, что нейропептиды легко проникают через гематоэнцефалический барьер (в отличие от полипептидных цепей факторов роста), трудно переоценить их потенциальную терапевтическую значимость. Одним из наиболее перспективных препаратов нейротрофического ряда является Цереброкурин, который содержит свободные аминокислоты, нейропептиды и низкомолекулярные продукты контролируемого протеолиза низкомолекулярных белков и пептидов эмбрионов крупного рогатого скота. Механизм действия и точки приложения Цереброкурина принципиально отличаются от других препаратов нейропептидной природы, в частности от церебролизина. Цереброкурин содержит пептиды, несущие в себе программу анализа состояния и строительства ЦНС. Таким образом, конечный эффект различается из-за качественно отличного механизма действия [45].

Защитные эффекты Цереброкурина на ткань мозга включают его оптимизирующее действие на энергетический метаболизм мозга и гомеостаз кальция, стимуляцию внутриклеточного синтеза белка, замедление процессов глутамат-кальциевого каскада и перекисного окисления липидов. Вместе с тем препарат обладает выраженными нейротрофическими эффектами. В исследованиях, проведенных в последние годы, установлена способность Цереброкурина повышать экспрессию гена — транспортера глюкозы (GLUT-1) через гематоэнцефалический барьер и таким образом увеличивать ее транспорт к головному мозгу в условиях экспериментальной ишемии [30, 53].

Показано также, что нейротрофические свойства Цереброкурина связаны с защитой цитоскелета нейронов вследствие ингибирования кальцийзависимых протеаз, в том числе кальпаина, и увеличения экспрессии микротубулярного кислого протеина 2 (MAP2). Наряду с этим Цереброкурин увеличивает аффинность связывания BDNF с его рецепторами. Влияние препарата на trk-B рецепторы нейротрофинов может свидетельствовать о вовлечении его в регуляцию естественных факторов роста. В экспериментальных исследованиях выявлена способность Цереброкурина предотвращать гиперактивацию микроглии и снижать продукцию ИЛ-1α и других провоспалительных цитокинов, что отражает влияние препарата на выраженность местной воспалительной реакции и процессов оксидантного стресса в ишемизированной зоне мозга. Нашими работами показано, что применение Цереброкурина при острой церебральной ишемии способствует лучшему выживанию нейронов в зоне ишемической полутени и торможению отсроченной гибели нейронов [5, 7, 27].

Помимо Цереброкурина широкое применение в неврологической практике нашел нейропептидный препарат кортексин. Кортексин содержит комплекс нейропептидов (адекватное, гармонично сбалансированное соотношение L-аминокислот, витаминов и микроэлементов для нормального функционирования нейронов). Молекулярная масса (в среднем 7 кДа) позволяет препарату проникать через гематоэнцефалический барьер и исключает любую возможность попадания в организм прионовой инфекции [28].

Препарат обладает высокой тропностью для всех отделов головного мозга, эффективен в комплексе лечебных мероприятий, применяемых при нарушениях периферической нервной системы. Нейрометаболитотропные, нейропротекторные, ноотропные и противосудорожные свойства кортексина позволили широко использовать его как в неврологии, нейрохирургии, психиатрии, так и в офтальмологии, особенно в тех случаях, когда имеющиеся патологические состояния сетчатки и других отделов глаза оказывают негативное воздействие на функцию зрительного нерва [28, 37, 38].

Мощное многофункциональное органотропное и регулирующее воздействие кортексина на важнейшие структуры головного мозга и других отделов нервной системы при минимальной фармакологической нагрузке (пациент получает за 10-дневный курс всего 100 мг пептидов) проявляются при лечении как пациентов всех возрастов, так и практически здоровых лиц, связанных с высокоэмоциональной и напряженной деятельностью нервной системы в осложненных условиях и в стрессовых ситуациях [37, 38].

Достаточно высокую ноотропную и церебропротективную активность продемонстрировал нейропептидный препарат семакс АКТГ(4–10), представляющий собой гептапептид (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro) и являющийся первым российским ноотропным препаратом неистощающего типа активности. При интраназальном введении семакс через 4 мин проникает через гематоэнцефалический барьер; период его полураспада в организме составляет несколько минут, а терапевтическое действие при однократном введении продолжается 20–24 ч.

Пролонгирование действия семакса связано с его последовательной деградацией, при которой большая часть эффектов нейропептида сохраняется у его фрагментов EHFPGP (Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro) и HFPGP (His-Phe-Pro-Gly-Pro), также являющихся стабильными нейропептидами, самостоятельно модулирующими холинергическую нейротрансмиссию и генерацию оксида азота. В экспериментах на культуре ткани продемонстрировано мощное трофотропное действие препарата на нейроны холинергической группы как в полной среде, так и в неблагоприятных условиях, обусловленных депривацией глюкозы и кислорода. При добавлении семакса в дозе 100 нМ и 10 мкМ выживаемость нейронов достоверно повышалась примерно в 2 раза, что было сопоставимо с аналогичным эффектом NGF. Предварительные экспериментальные данные показывают, что рецепторы к семаксу очень близки к меланокортиновым рецепторам MC3, MC4 и MC5 типов. Поскольку меланокортин является производным проопиомеланокортина, имеющего с АКТГ идентичную последовательность 13 аминокислот, такое предположение представляется реальным [30]. В экспериментах на животных установлено, что даже в очень малых дозах (3 мкг/кг) семакс обладает ярко выраженным ноотропным эффектом, увеличивает адаптационные возможности мозга, повышая его устойчивость к стрессорным повреждениям, гипоксии и ишемии. Более высокие дозы семакса (150–300 мкг/кг), не являясь токсичными и сохраняя ноотропные свойства малых доз, оказывают выраженное антиоксидантное, антигипоксическое, ангиопротекторное и нейротрофическое действие [6, 19, 21].

Клинико-иммунологический анализ показал иммуномодулирующую и нейротрофическую активность препарата: отмечалось повышение уровня противовоспалительных цитокинов, трофических факторов (IL-10, TNF-α, TGF-β₁, BDNF, NGF), снижение экспрессии генов раннего реагирования c-fos, антиапоптического белка bcl-2, а также повышение активности СОД в цереброспинальной жидкости. Противовоспалительные, антиоксидантные, нейротрофические и антиапоптозные эффекты семакса могут быть связаны с его влиянием на молекулярные триггерные механизмы отдаленных последствий ишемии [19, 31].

Проведенные нами экспериментальные исследования показали достаточно высокую способность нейропептидов (Цереброкурин, кортексин, семакс) влиять на экспрессию генов раннего реагирования c-fos и связанные с ней процессы апоптической гибели нейроцитов на различных модельных патологиях.

Так, лечебно-профилактическое введение Цереброкурина, кортексина и семакса животным при моделировании хронического иммобилизационного стресса приводило к достоверному снижению (р ≤ 0,01) числа с-fos-позитивных нейронов в зоне CA₁ гиппокампа по сравнению с контрольной группой животных. Как видно из рис. 4 и 5, наиболее активным нейропептидом оказался Цереброкурин, который снижает количество с-fos-позитивных нейронов более чем на 70 % по отношению к контролю.

За счет подавления экспрессии генов раннего реагирования c-fos Цереброкурин, кортексин и семакс способны в определенной степени влиять на процессы апоптотической гибели нейрона, в условиях стресса. Это подтверждается нашими исследованием содержания антиапоптического bcl-2 белка в зоне CA₁ гиппокампа. Введение нейропептидов увеличивало количество bcl-2 белка в зоне CA₁ гиппокампа по сравнению с контрольной группой животных (p ≤ 0,01), при этом Цереброкурин статистически достоверно (p ≤ 0,01) превышал показатели кортексина и семакса [6, 15].

Защитное действие Цереброкурина, кортексина, семакса проявлялось в восстановлении когнитивных функций животных, что выражалось увеличением латентного времени захода животных в темный отсек (рис. 6).

Как нами было описано выше, 30-дневное введение крысам алкоголя приводило к снижению экспрессии генов раннего реагирования c-fos и, следовательно, к нарушению процессов обучения и памяти. Курсовое назначение нейропептидов приводило к увеличению количества с-fos-позитивных нейронов в зоне CA₁ гиппокампа по отношению к контрольной группе (рис. 7). Важно отметить, что увеличение экспрессии гена c-fos под влиянием Цереброкурина протекало на фоне восстановления когнитивных функций алкоголизированных животных (рис. 8).

В условиях моделирования ишемического повреждения головного мозга нейропептиды также продемонстрировали способность на 21-е сутки (восстановительный период) нормализовать экспрессию гена c-fos. Данный эффект нейропептидов является одним из главных звеньев их церебропротективного действия — за счет усиления экспрессии гена c-fos изменялся морфологический тип гибели нейронов, переключаясь на более «мягкий» апоптический путь. Апоптическая гибель нейронов является оптимальным, упорядоченным процессом прекращения жизнедеятельности деструктивно измененных нейронов, при котором стабилизируются клеточные мембраны, содержание клеток утилизируется путем образования апоптических телец и их фагоцитоза без развития воспалительной реакции. Из рис. 9 видно, что наиболее активным оказался Цереброкурин, увеличивая количества c-fos белка в нейроцитах на 50 % по отношению к контролю. Следует отметить, что при ишемическом повреждении головного мозга введение нейропептидов приводило не к гиперэкспрессии генов, а их нормализации [4].

Вопрос о значении апоптоза в условиях ишемии головного мозга остается спорным, однако все больше фактов свидетельствует в его пользу [11, 22]. В отличие от апоптоза некроз клетки — более грубое разрушение, которое сопровождается вакуолизацией, резким набуханием клетки, лизисом мембран, выходом клеточного содержимого в межклеточное пространство. Это сопровождается усилением синтеза воспалительных интерлейкинов и цитокинов, развитием воспаления. В зависимости от степени экспрессии ген c-fos регулирует процессы апоптоза/некроза. Нормализация экспрессии данного гена под влиянием нейропептидов при ишемическом повреждении нейронов на 21-е сутки приводила к увеличению количества глиальных клеток и нейронов в коре головного мозга, а также к повышению их морфофункциональной активности (увеличение содержания РНК) (табл. 1, рис. 10).

Таким образом, полученные нами результаты позволяют говорить о существенных различиях в силе фармакологического эффекта нейропептидов. Все изученные препараты — семакс, кортексин, Цереброкурин показали достоверно отличающиеся результаты, которые, очевидно, объясняются различным происхождением и поэтому разным механизмом действия. Наиболее перспективной видится дальнейшая разработка препарата Цереброкурин, показавшего самую высокую активность в фармакокоррекции нейродеструктивных заболеваний, которая является актуальной проблемой медицины и фармакологии.