Газета «Новости медицины и фармации» 13-14(249-250) 2008

Продолжение. Начало в № 12(248) 2008 г.

Цитокины

Цитокины — продуцируемые активированными клетками низкомолекулярные белково-пептидные факторы, которые осуществляют короткодистантную регуляцию межклеточных взаимодействий всех звеньев иммунной системы, а также межсистемные взаимодействия. Цитокины определяют выживаемость, стимуляцию или угнетение роста клеток, их дифференцировку, функциональную активацию и апоптоз [29, 35].

После взаимодействия цитокинов с соответствующими рецепторами на поверхности клеток сигнал через элементы внутриклеточного преобразования передается в ядро клетки, где активируются соответствующие гены, ответственные за выработку клеткой низкомолекулярных белковых веществ — регуляторов упомянутых выше процессов.

Цитокины — это гормоноподобные молекулы. Действие их происходит через высокоаффинные, высокоспецифические рецепторы на мембране клетки-мишени. В отличие от классических гормонов большинство цитокинов — молекулы паракринного, локального действия. Они вырабатываются и используются клетками, которые находятся в тесной близости. Вместе с тем возможно действие и на ту же клетку, которая секретировала данный цитокин (аутокринное действие).

Секреция цитокинов — краткосрочный процесс. Время полураспада большинства цитокинов в кровотоке измеряется минутами.

В настоящее время наиболее хорошо изученными и наиболее часто используемыми в диагностических целях являются цитокины иммунной системы и факторы роста.

В зависимости от того, какие клетки иммунной системы преимущественно синтезируют тот или иной цитокин, различают интерлейкины, монокины и лимфокины. Цитокины можно разделить на несколько «семейств»: интерлейкины (в настоящее время известно 23 интерлейкина: IL-1 — IL-23), интерфероны, опухоленекротизирующие факторы, трансформирующие факторы роста, хемокины и др. (табл. 1).

Условно выделяют четыре группы цитокинов иммунной системы [7, 29, 35]:

— гемопоэтические факторы (колониестимулирующие факторы, IL-3, IL-7, эритропоэтин) — стимуляторы роста и созревания незрелых кроветворных клеток;

— регуляторы естественного (врожденного, неинфекционного) иммунитета (IFN-β и -α, IL-1 и IL-6, TNF-α, хемокины IL-8, MCP-1, RANTES и др.). Они участвуют в неспецифической защите организма от бактериальных и вирусных инфекций. Их основные мишени — клетки-макрофаги и гранулоциты;

— цитокины, регулирующие специфические иммунные реакции (IL-2, IL-4, трансформирующий фактор роста — TGF-β и др.). Они участвуют в активации, росте и дифференцировке зрелых лимфоцитов;

— цитокины, регулирующие воспалительные реакции, развивающиеся в процессе специфического иммунного ответа (IFN-γ, лимфотоксин, IL-5, IL-10 и др.). Они активируют неспецифические эффекторные клетки — цитотоксические макрофаги и естественные киллеры.

При критических состояниях антигенная стимуляция приводит к секреции цитокинов «первого поколения» — IL-1 и IL-6, TNF-α, которые индуцируют синтез центрального регуляторного цитокина IL-2, а также IL-3, -4, -5, IFN-γ и др. — цитокинов «второго поколения». Они, в свою очередь, влияют на синтез ранних цитокинов. Этот принцип позволяет не только регулировать иммунный ответ, но распространять и усиливать его, вовлекая все большее число клеток.

Так, IL-2 появляется в цитоплазме Т-клеток уже через 2 ч после стимуляции; IL-4 — через 4 ч, IL-10 — через 6 ч, IL-9 — через 24 ч. Пик выработки различных лимфокинов варьирует от 12 ч для IL-2, 48 ч для IL-4 и IL-5 до 72 ч для IL-9 и IFN-γ.

Эффекты цитокинов иммунной системы тесно связаны с физиологическими и патофизиологическими реакциями организма. При этом происходит модуляция как локальных, так и системных механизмов защиты. Одна из важнейших функций системы цитокинов — обеспечение согласованного действия иммунной, эндокринной и нервной систем в ответ на стресс [10, 29].

Клиническая ценность определения некоторых цитокинов в диагностике синдромов критических состояний

Интерлейкин-1 (IL-1α, IL-1β) играет одну из центральных ролей в воспалительной реакции, в ответе на бактериальную инфекцию, повреждение тканей, вызванное ультрафиолетовым облучением. Стимулирует секрецию гепатоцитами сывороточных амилоидов А и Р, С-реактивного белка, гаптоглобина, α₁-антитрипсина, церулоплазмина. IL-1 участвует в регуляции температуры тела, его повышенная продукция приводит к развитию лихорадки. Глюкокортикостероиды и простагландины снижают активность IL-1. Сильное повышение уровня IL-1 приводит к артериальной гипотонии, анорексии.

Повышение уровня IL-1 наблюдается при септическом шоке, воспалительном поражении кишечника, сахарном диабете I типа.

Интерлейкин-2 (IL-2) играет исключительно важную роль в реализации механизмов иммунного ответа.

Интерлейкин-4 (IL-4) — лимфокин, оказывающий наиболее сильный эффект на регуляцию образования других цитокинов посредством участия в многочисленных биологических процессах, таких как иммунный ответ и воспалительные реакции.

Интерлейкин-6 (IL-6) индуцирует синтез белков острой фазы, в связи с чем (наряду с IL-1 и TNF-α) его относят к провоспалительным цитокинам. Есть данные о повышении IL-6 и TNF-α в плазме крови при различных атопических реакциях (аллергия, астма).

Интерлейкин-8 (IL-8) известен как фактор активации нейтрофилов. Этот хемокин активирует нейтрофилы, в меньшей степени другие гранулоцитарные лейкоциты, вызывая их хемотаксис в очаг воспаления. IL-8 активирует также и моноциты. Повышенный уровень IL-8 ассоциируется с хроническими и острыми воспалительными состояниями, коррелирует с тканевой инфильтрацией нейтрофилами при язвенном колите.

Фактор некроза опухоли альфа (TNF-α) повышает проницаемость капилляров, повреждает эндотелий сосудов, вызывает гиперкоагуляцию, активирует систему комплемента с последующей аккумуляцией нейтрофилов и внутрисосудистым тромбообразованием. Повышение уровня TNF-α у больных с сепсисом носит фазный характер. Снижение сывороточного уровня TNF-α при упорной инфекции отражает несостоятельность системы защиты организма (В.С. Тимохов с соавт., 1997).

В научной литературе встречается условное деление цитокинов на провоспалительные (IL-1, -3, -6, -8, -12; TNF-α; IFN-γ; CSF) и противовоспалительные (IL-4, -10, -13; TGF-β).

По мнению R.C. Baker и соавт. (2002), провоспалительные цитокины в норме редко определяются в плазме. Их появление и нарастание титров в плазме отмечается при развитии воспалительной реакции. Противовоспалительные цитокины (в противоположность провоспалительным) постоянно присутствуют в плазме в измеряемых концентрациях.

Теоретически R.C. Baker с соавт. (2002) объясняют этот феномен различной молекулярной массой цитокинов упомянутых двух групп. Так, провоспалительные цитокины обладают довольно низким молекулярным весом (TNF-α = 17 кД; IL-1 = 17 кД; IL-3 = 15–28 кД; IL-6 = 21–28 кД; IL-8 = 8–10 кД), что позволяет почкам их фильтровать и выводить из организма. Противовоспалительные цитокины обладают довольно высокой молекулярной массой, что способствует их сохранению в плазме.

В настоящее время нет единого мнения относительно уровня у здоровых доноров ключевого медиатора воспаления — TNF-α. Так, по данным группы компаний «БиоХимМак» (2002), концентрация циркулирующего TNF-α у здоровых очень низка (< 5 пг/мл), с резким возрастанием (максимум в течение 90 мин) после введения LPS, превышает значения 300 пг/мл во время септического шока [10]. Норма сывороточной концентрации TNF-α у здоровых для тест-систем ООО «Цитокин» составляет от 0 до 50 пкг/мл [35]. О.В. Куценко с соавт. (AML. — VII (3). — 2001) нормой TNF-α считают < 2 пг/мл. Другие авторы приводят значения сывороточного TNF-α у здоровых от 8,98 ± 0,68 пг/мл (И.П. Шлапак с соавт., 2002); 16 ± 3 пг/м л (Т.Е. Белокриницкая, Ю.А. Витковский, 1999); 34,3 ± 6,3 пг/мл (Т.И. Гавриленко с соавт., 2002); 40,5 ± 6,3 пг/мл (В.Н. Коваленко с соавт., 2001) до 75,3 ± 15,6 пг/мл (В.С. Тимохов с соавт., 1997).

Содержание в сыворотке крови фактора некроза опухоли альфа — tumor necrosis factor alfa (TNF-α)

Показатели у здоровых лиц, принятые в качестве региональной нормы (по данным авторов): 76,90 ± ±  3,360 пг/мл. Референтные величины: 55,79–90,07 пг/мл.

Диагностическое значение. Определение уровня TNF-α нельзя отнести к широко доступным, повседневным, обычным, так называемым рутинным лабораторным исследованиям. Однако ключевая роль фактора некроза опухоли альфа — TNF-α (кахектина) в развитии критических состояний (наряду с некоторыми другими цитокинами — медиаторами воспаления) требует осветить ряд принципиальных моментов.

Главный источник TNF-α — активированные моноциты-макрофаги. TNF-α обладает ярко выраженной способностью вызывать геморрагический некроз опухоли, скорее всего, опосредованно через эндотелий сосудов, питающих опухоль. В высокой концентрации он способен повреждать клетки эндотелия и увеличивать микроваскулярную проницаемость. Это вызывает активирование системы гемостаза и комплемента, за которым следует аккумуляция нейтрофилов и микрососудистое тромбирование.

Увеличение в сравнении с контролем уровня TNF-α свыше 600 пкг/мл свидетельствует о наличии цитокиновой гиперактивации, а в сочетании с моноцитозом, тромбоцитопенией, лимфопенией, снижением количества CD25 (ИЛ-2 Р-позитивных клеток) является лабораторным признаком синдрома системного воспалительного ответа — SIRS.

Прогностическое значение уровня TNF-α определяется следующим образом:

— понижение уровня TNF-α в сравнении с контролем или отсутствие отличия его от контрольных показателей в сочетании с моноцитозом, лимфопенией, нейтрофилезом, увеличением ЯИ свидетельствует о наличии метаболического иммунодефекта;

— низкий (ниже 30 пкг/мл) в сравнении с контролем уровень TNF-α при критическом состоянии, отсутствие его динамики под влиянием лечения наряду с сохранением моноцитопении, лимфопении, увеличением ЯИ свидетельствует о наличии иммунопаралича и является плохим прогностическим признаком;

— повышенный (свыше 700 пкг/мл) в сравнении с контролем уровень TNF-α при критическом состоянии, а также его увеличение в динамике более 1000 пкг/мл в сочетании с сохранением моноцитоза, нейтрофилеза, лимфопении, тромбоцитопении, увеличением ЯИ, уровня СМ, а также под влиянием агрессивной антибактериальной терапии свидетельствует о срыве регуляторных механизмов продукции TNF-α и является отражением «неуправляемого цитокинового каскада», признаком иммунотоксикоза [1, 18, 37, 38, 40].

Способы объективизации эндотелиальной дисфункции при критических состояниях

Сложившийся традиционный взгляд на клеточный иммунитет как на процесс взаимодействия ограниченного числа иммунокомпетентных клеток, преимущественно лимфоцитов и макрофагов, в настоящее время претерпел существенное переосмысление. Убедительно доказано, что цепь иммунологических реакций включает ряд дополнительных звеньев, которые первоначально не рассматривались в качестве компонентов иммунного ответа. В связи с этим особый интерес представляет роль эндотелиальных клеток в развитии иммунных реакций, лежащих в основе формирования системной воспалительной реакции на экстремальную агрессию [17, 33, 41, 52].

Эндотелий сосудов выполняет многообразные функции, в том числе селективные транспортные и барьерные, участвует в метаболизме внеклеточного матрикса, биосинтезе разнообразных цитокинов (И.С. Фрейндлин, 1996, 1997–2003), регулирует процессы коагуляции и агрегации тромбоцитов. Целостность эндотелия сосудов, сохранение избирательной проницаемости в отношении фагоцитов, тромбоцитов и факторов свертывания исключительно важны для нормального функционирования микроциркуляции и гемостаза.

Эндотелий сосудов представляет собой гормонально активную ткань, которую называют самой большой «эндокринной железой» человека. Если выделить из организма все клетки эндотелия, их вес составит около 2 кг, а общая протяженность — около 7 км, площадь эндотелия приблизительно равна 6 теннисным кортам.

Уникальное расположение клеток эндотелия на границе между циркулирующей кровью и тканями делает их наиболее уязвимыми для различных патогенных факторов, находящихся в системном и тканевом кровотоке. Именно эти клетки первыми встречаются с реактивными свободными радикалами, окисленными липопротеинами низкой плотности, гиперхолестеринемией, гипергликемией, различными цитокинами, малыми молекулами, в том числе и инфекционного происхождения.

Дисфункция эндотелия лежит в основе формирования синдрома полиорганных нарушений при критических состояниях. В этой связи объективизация эндотелиальной дисфункции в экстремальной медицине приобретает особое значение [13, 14, 16, 21].

Активность фактора фон Виллебранда. Фактор фон Виллебранда (von Willebrand factor — vWF) — многомерный гликопротеин – выполняет главную посредническую роль во взаимодействии компонентов плазменного и сосудисто-тромбоцитарного гомеостаза. Синтезируется в клетках сосудистого эндотелия и мегакариоцитах. Высвобождается в системный кровоток, и затем его большая часть кумулируется в эндотелиальных клеточных органеллах и α-гранулах тромбоцитов, из которых происходит его повторное высвобождение. Исследуют влияние плазменного vWF на агглютинацию тромбоцитов под воздействием ристомицина. Материал — цитратная капиллярная кровь пациента.

Показатели у здоровых лиц, принятые в качестве региональной нормы (по данным Б.Ф. Архипова, Л.З. Баркагана, Л.В. Марамзиной, 1982): 103,00 ± 4,30 %. Референтные величины: 80–120 %.

Диагностическое значение. Повышение уровня и активности vWF в плазме крови происходит при стимуляции или повреждении сосудистого эндотелия, индукции адгезии и агрегации тромбоцитов. Факторами повреждения эндотелия служат модифицированные липопротеиды, эндотелиотропные вирусы, иммунные комплексы, гемодинамические перегрузки, ишемия, гипоксия, воздействие гистамина, адреналина, фибрина, эндотоксинов, цитокинов (TNF-α, IL-1β), свободных радикалов и т.д. (М. Ситникова, 2004). В соответствии с этими механизмами повышение уровня и активности vWF наблюдается при критических состояниях, а также в клинических ситуациях, сопровождающихся хроническим диссеминированным внутрисосудистым свертыванием крови (тромбинемия), повреждением эндотелия сосудистой стенки и активацией тромбоцитов, в том числе при иммунных и иммунокомплексных заболеваниях, диабетических ангиопатиях, ИБС, гипертонической болезни и т.д. [39]. W.F. Penny с соавт. (1991) и M.G. Conlan с соавт. (1993) установлено, что высвобождение vWF при этих патологиях пропорционально интенсивности повреждающего воздействия на сосудистый эндотелий. Принимая во внимание, что с позиций концепции системного воспалительного ответа в основе формирования ПОН при критических состояниях лежит универсальное повреждение сосудистого эндотелия, диагностическое значение выявления повышенного уровня активности vWF у больных, находящихся в критических состояниях, трудно переоценить.

Молекулы адгезии в диагностике нарушений иммунитета при критических состояниях

Нарушения микроциркуляции при критических состояниях обусловлены гуморальным и клеточным компонентами. Гуморальный компонент включает локальную активацию цитокинов IL-1, IL-2, IL-6, TNF-α, факторов свертывания, свободных радикалов, протеолитических ферментов, образование вазоактивных продуктов арахидоновой кислоты. Клеточный компонент состоит в активации лимфоцитов, моноцитов, нейтрофилов. И клеточные, и гуморальные компоненты взаимодействуют между собой и с адгезивными молекулами (АМ), количество которых увеличивается в крови пациентов в критических состояниях.

Молекулы клеточной адгезии — гетерогенная группа белков, которые постоянно присутствуют на мембране клеток (эндотелиоцитов, лейкоцитов, тромбоцитов). В настоящее время адгезивные молекулы делят на три большие группы (табл. 2): суперсемейство иммуноглобулинов — эндотелиальные Ig-подобные белки; интегрины — трансмембранные белки, расположенные на поверхности клеток и способные связываться с другими белками и передавать внеклеточные сигналы; селектины — комплементарные белки, располагающиеся на эндотелии (Е), тромбоцитах (Р), лейкоцитах (L).

Адгезивные молекулы обеспечивают следующие процессы. Для лейкоцитов: прикрепление к сосудистому эндотелию, трансмиграцию через эндотелий, прикрепление к экстрацеллюлярному матриксу (фибронектин, ламинин, коллаген). Для лимфоцитов: прикрепление друг к другу, реализацию хомминг-эффекта (миграцию Т- и В-зоны в периферических лимфоидных органах), прикрепление к антигенпрезентирующим клеткам. Для тромбоцитов: прикрепление к лейкоцитам, прикрепление к эндотелиоцитам.

Адгезивность увеличивается под воздействием лейкотриенов, факторов тромбоза, С5а-компонента комплемента, бактериального липополисахарида и некоторых цитокинов (IL-8).

Молекула адгезии может быть не только в связанной с мембраной форме. В циркулирующей крови содержатся растворимые изоформы, содержание которых увеличивается вследствие либо экспрессии белка, либо протеолитического отщепления, которое ведет к повреждению эндотелия. Так, при воспалении Р-селектин быстро экспрессируется активированными тромбоцитами, а тромбин, гистамин и свободные радикалы производят мобилизацию АМ в течение минут.

Растворимые формы АМ — это биологически активные вещества. Растворимая форма ELAM-1 избирательно связывается с клетками, у которых на поверхности имеются аналогичные молекулы. Эта же форма регулирует функцию нейтрофилов путем увеличения взаимодействия нейтрофила с эндотелием. Растворимая форма ICAM-1 способна связывать антиген клеточной адгезии, активируя противоположный процесс — деадгезию. Так, растворимая форма ICAM-1 может конкурировать с мембраносвязанной формой за лейкоцитарную АМ, предотвращая повреждение ткани. Растворимая форма GMP-140
способна ингибировать адгезию нейтрофилов к эндотелию, блокируя вызванную TNF активацию интегринового комплекса.

Для растворимых молекул адгезии ICAM-1 и GMP-140 определены механизмы, с помощью которых они оказывают противовоспалительное действие.

В настоящее время роль адгезивных молекул на различных этапах миграции лейкоцита при развитии воспаления представляется в виде так называемого каскада адгезии (рис. 1).

Каскад адгезии

I. Этап атаки. Под влиянием цитокинов на поверхности эндотелия и лейкоцитов появляются молекулы семейства селектинов. Под их воздействием лейкоцит замедляет движение, приближается к эндотелию и начинает «катиться» (rolling) по его поверхности, но не останавливается.

II. Этап активации (начальной адгезии). Фактор активации тромбоцитов, IL-8, селектины из эндотелиальных клеток оказывают воздействие на нейтрофилы, потенцируя их адгезию к эндотелию. В этом процессе также участвуют такие молекулы, как фибронектин, фибрин, фрагменты комплемента.

III. Этап адгезии (прикрепления). По мере приближения под влиянием хемокинов к месту воспаления лейкоциты прилипают к эндотелию (распластываются). Этому способствуют интегрины лейкоцитов и выделяемые эндотелиоцитами АМ: ICAM-I, ICAM-2, VCAM-1, MAdCAM-1.

IV. Этап трансэндотелиальной миграции. Лейкоциты при помощи интегринов и тромбоцитарно-эндотелиальной адгезивной молекулы проникают между клетками эндотелия, экспрессирующими ECAM-1, ICAM-I, VCAM-1.

V. Этап субэндотелиальной миграции. Лейкоциты, экспрессирующие АМ (интегрины, CD44), проникают из сосуда в ткани.

Для диагностики нарушений иммунитета у больных в критических состояниях имеет значение количественное определение АМ в плазме крови:

— как маркеров активности воспалительного процесса (T.M. Carlos, J.M. Harlan, 1994);

— как маркеров СПОН и ее прогноза (O.V. Hein и соавт., 1998).

Уровень растворимых молекул адгезии s-ICAM-1 может быть определен с использованием тест-систем для иммуноферментного анализа.

Показатели у здоровых лиц, принятые в качестве региональной нормы (по данным Т.И. Гавриленко с соавт., 2002): 76,90 ± 3,360 нг/мл.

Диагностическое значение. По данным G.P. Downey, L. Fialkow (1995), концентрация АМ в плазме крови может служить критерием исхода критического состояния. Так, концентрация s-ICAM-1 у больных с сепсисом, которые погибли, составила 1793 ± ± 1026 нг/мл, а у выживших — 786 ± ± 454 нг/мл. По мнению авторов, концентрация s-ICAM-1 выше 1000 нг/мл свидетельствует о высокой вероятности летального исхода.

По данным O.V. Hein с соавт. (1998), концентрация s-ICAM-1 при септическом шоке является маркером повреждения эндотелия и прогностическим фактором исхода септического шока. По данным A. Yaguchi с соавт. (1998), факторами прогноза СПОН можно считать эндотелиальный фактор роста, фактор 4 тромбоцитов.

Оксид азота в диагностике нарушений иммунитета при критических состояниях

Оксид азота (NO) — медиатор внутриклеточного и межклеточного взаимодействия, важнейший медиатор иммунной, сердечно-сосудистой, дыхательной, нервной, пищеварительной и мочеполовой систем (Р.И. Сепиашвили с соавт., 2001; О.В. Синяченко, Т.В. Звягина, 2001). Все многообразие биологических эффектов NO можно разделить на 3 типа (Г.А. Рябов, Ю.М. Азизов, 2001):

— регуляторное влияние NO на сосудистый тонус, адгезию клеток, проницаемость сосудов, нейротрансмиссию, бронходилатацию, агрегацию тромбоцитов, систему противоопухолевого иммунитета, функцию почек;

— защитное действие NO, проявляющееся в его антиоксидантной активности, ингибировании адгезии лейкоцитов и защите от токсического воздействия TNF-α;

— повреждающее действие NO, выражающееся в ингибировании ряда ферментов, нарушении структуры ДНК, индукции процессов перекисного окисления липидов, снижении антиоксидантного потенциала клеток, повышении их чувствительности к радиации, алкилирующим агентам и токсичным ионам металлов.

NO вырабатывается различными клетками организма — эндотелиоцитами, эпителиоцитами, мезангиоцитами, миоцитами, лимфоцитами, нейтрофилами, тромбоцитами, макрофагами, моноцитами, фибробластами, нейронами, гепатоцитами, тучными клетками — и контролирует в них многие функции и биохимические процессы (Р.И. Сепиашвили с соавт., 2001; О.В. Синяченко, Т.В. Звягина, 2001).

В свободном состоянии NO — бесцветный газ, не имеющий запаха и обладающий высокой реакционной способностью. NO представляет собой двухатомную свободнорадикальную молекулу массой 28 Д. Отсутствие заряда и малые размеры молекулы обеспечивают ее липофильность и высокую проницаемость через мембраны клеток и субклеточных структур. Среднее время жизни NO в биологических тканях составляет 5,6 с. Наличие одного электрона с неспаренным спином придает молекуле NO высокую реакционную способность с широким спектром биологического действия. В основе многих биохимических феноменов NO лежат три основные реакции:

— взаимодействие с гемовым и негемовым железом;

— реакции с SH- и NH2-группами и участие в свободнорадикальных процессах (Г.А. Рябов, Ю.М. Азизов, 2001).

В организме NO синтезируется в процессе окисления L-аргинина гемсодержащим ферментом NO-синтазой (NOS). Идентифицированы три изофермента NOS, которые кодируются разными генами и различаются структурой, распределением, функцией и регуляцией.

Нейрональная (nNOS, I тип) и эндотелиальная (eNOS, III тип) NO-синтазы представляют собой конститутивные ферменты, экспрессированные в эндотелиоцитах, нейронах, тромбоцитах, нейтрофилах и других клетках. Их активность зависит от присутствия кальция-кальмодулина и обеспечивает нейропередачу в нитритергических нейронах, релаксацию кровеносных сосудов и гладкомышечных органов, антиадгезию и антиагрегацию циркулирующих клеток крови, регуляцию синтеза и секреции гормонов (Р.И. Сепиашвили с соавт., 2001).

Индуцибельная NOS (iNOS, II тип) быстро экспрессируется под воздействием бактериальных продуктов, воспалительных цитокинов и активных форм кислорода в иммунных, эндотелиальных, гладкомышечных и других клетках, обеспечивая синтез значительно большего количества NO, чем конститутивные изоформы (О.В. Синяченко, Т.В. Звягина, 2001). Активность iNOS не зависит от присутствия кальция. Основной функцией продуцируемого ею NO является участие в иммунных процессах, таких как антипатогенные реакции, неспецифическая цитотоксичность, противоопухолевая защита, отторжение трансплантата и др. (Г.А. Рябов, Ю.М. Азизов, 2001). В норме iNOS практически не обнаруживается в клетках. Однако ее синтез индуцируется под действием провоспалительных цитокинов — IFN-γ, TNF-α и бактериального липополисахарида.

Роль оксида азота при инфекционной патологии

Защита от возбудителей инфекций — одна из важнейших функций иммунной системы. Патоген, попадая в организм, вызывает сложный комплекс иммунных реакций, направленных как на элиминацию возбудителя, так и на деструкцию клеток организма хозяина. NO при этом выполняет как регуляторные, так и эффекторные функции, оказывая протективное или тканеповреждающее воздействие в зависимости от стадии иммунного ответа (C. Bogdan с соавт., 2000).

При внеклеточной локализации возбудителя основную роль играет триада: нейтрофил, иммуноглобулин (опсонин), комплемент. При внутриклеточной локализации патоген недоступен для антител и ведущая роль в его уничтожении принадлежит триаде: Т-лимфоцит, NK-клетки (естественные киллеры), макрофаги (Р.М. Хаитов, Б.В. Пинегин, 1997). Участие оксида азота (NO) на основных этапах противоинфекционной защиты демонстрируется на рис. 2.

Фагоцитоз и синтез NO осуществляют активированные макрофаги и нейтрофилы. В первые 4 ч после попадания возбудителя в организм человека включаются неспецифические механизмы врожденного иммунитета, в реализации которых принимают участие нейтрофилы, макрофаги, NK-клетки, система комплемента (по альтернативному пути). Микробы поглощаются и разрушаются фагоцитами — макрофагами и нейтрофилами. Активация фагоцитов индуцирует выработку ими провоспалительных цитокинов. При этом TNF-α и IL-12 стимулируют NK-клетки, которые начинают синтезировать IFN-γ. TNF-α и IFN-γ активируют iNOS в иммунокомпетентных клетках. Особо следует отметить роль NO в эрадикации внутриклеточных инфекций, когда клетки-хозяева (моноциты, макрофаги), несущие внутриклеточный патоген-возбудитель, защищены от гуморальных агентов и лекарственной терапии. Большинство этих бактерий (Chlamidia, Francisella, Listeria, Mycobacterium, Toxoplasma) и простейшие (Entamoeba, Leishmania, Plasmodium и Trypanosoma) проявляют исключительную чувствительность к NO-зависимым защитным процессам в инфицированном организме (С.Я. Проскуряков с соавт., 2000). В ранней фазе иммунного ответа NO, помимо эффекторных, выполняет и важные регуляторные функции. Так, в течение первых часов инфицирования внутриклеточным патогеном Leishmania major локальная активация iNOS/NO не только обеспечивает антимикробное действие, но также контролирует функцию NK-клеток и экспрессию IFN-γ. NO является важным условием для передачи сигналов цитокинами и нормального функционирования механизмов врожденного иммунитета (F.C. Fang, 1997).

Ранний ответ адаптивного иммунитета (4–96 ч после внедрения возбудителя) сопровождается распознаванием антигена, рекрутированием и активацией эффекторных клеток.

Поздний адаптивный ответ на инфекцию (после 96 ч) сопровождается антигенспецифической пролиферацией Т- и В-лимфоцитов с дифференцировкой их в эффекторные клетки. В этой фазе происходит синтез антител (IgM, IgA), активация комплемента по классическому пути, Т-клеточная активация макрофагов с помощью IFN-γ.

С одной стороны, NO активно участвует в подавлении и элиминации возбудителей инфекционных болезней, с другой — избыточное повышение концентрации этого свободного радикала играет важную роль в повреждении тканей, развитии токсико-инфекционного шока, транслокации бактерий и полиорганной недостаточности (Р.И. Сепиашвили с соавт., 2001).

NO в патогенезе токсико-инфекционного шока

Среди многочисленных патологических состояний, в развитии которых важная роль принадлежит NO, особое место занимает септический шок. Под воздействием провоспалительных цитокинов — IFN-γ, TNF-α, бактериальных эндотоксинов, а затем и интерлейкинов-6, -8 активируется iNOS и в течение длительного времени синтезируется избыточное количество NO, вызывающего выраженную вазодилатацию, обусловленную активацией гуанилатциклазы и образованием циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ) (М.Ю. Киров с соавт., 2000). В условиях системной воспалительной реакции резко возрастает продукция супероксиданиона макрофагами и полиморфноядерными нейтрофилами (П.П. Голиков с соавт., 2000). Отмечается быстрая сопряженная реакция между оксидом азота и супероксиданионом с образованием пероксинитрита (ONOO–) (Р.И. Сепиашвили с соавт., 2001). Пероксинитрит обладает гораздо большей реакционной способностью, чем NO или супероксиданион, является сильным ДНК-расщепляющим агентом и стимулирует апоптоз и мутацию различных клеток, подавляет транспорт электронов в митохондриях (Г.А. Рябов, Ю.М. Азизов, 2001).

Развернутая картина септического шока характеризуется системной гипотензией, рефрактерной к катехоламинам, гипоперфузией тканей на фоне повышенной проницаемости эндотелия.

Эффекты NO могут быть частично нейтрализованы путем применения метилтионина или метиленового синего, механизм действия которого обусловлен неселективным ингибированием цГМФ и iNOS (М.Ю. Киров с соавт., 2000).

Так, метиленовый синий, вводимый болюсно в дозе 1–2 мг/кг пациентам с септическим шоком, приводил к повышению уровня АД, системного сосудистого сопротивления, восстановлению чувствительности адренорецепторов к катехоламинам и нормализации плазменных концентраций цГМФ и продуктов метаболизма NO, нитратов и нитритов, улучшал сократительную способность миокарда и газообмен и может быть использован для коррекции сосудистой недостаточности при септическом шоке (М.Ю. Киров с соавт., 2000).

Методы оценки метаболизма оксида азота. Определение в биологических жидкостях нитритов/нитратов

Суточная продукция NO одним только эндотелием составляет 1,7 ммоль, а базальная концентрация его в плазме приближается к 3 нмоль. Уровень NO для клеток эндотелия оценивается в 4 пмоль/мин на 1 мг белка (Т.В. Звягина, 2002). Вследствие быстрого перехода в нитраты и нитриты свободный радикал NO имеет короткий период полужизни (5–30 с), что объясняет трудности его выявления в биологических жидкостях (Т.В. Звягина, 2002).

Сумму конечных продуктов метаболизма NO (нитритов (NO₂)/нитратов (NO₃)) в биологических жидкостях (кровь, моча, перитонеальная, бронхоальвеолярная, синовиальная жидкости, конденсат выдыхаемого воздуха) определяют по L.C. Green с соавт. с учетом рекомендаций О.М. Драпкиной, Н.В. Кулаковой (Т.В. Звягина, 2002). Поскольку NO₂ является неустойчивым анионом и легко окисляется до NO₃, для определения суммы метаболитов NO нитрат-ион восстанавливают с помощью металлического кадмия, импрегнированного медью, до нитрит-иона, содержание которого определяют с помощью реактива Грейса (Т.В. Звягина, 2001).

Исследуя кровь, ее центрифугируют в течение 5 мин (2000 об./мин). Сыворотку можно замораживать и хранить до измерения показателей при t = –30 °С.

Уровень суммы метаболитов NO (мNO) (нитритов/нитратов) в сыворотке крови определяют количественно спектрофотометрически при длине волны 540 нм после построения калибровочной кривой для оптической плотности стандартных растворов NaNO₂ в диапазоне концентраций от 0 до 150 мкмоль.

Показатели у здоровых лиц, принятые в качестве региональной нормы (по данным авторов): 4,4 ± 0,10 мкмоль/л. Референтные величины: 4,08–4,56 мкмоль/л.

Апоптоз и некроз клеток периферической крови при критических состояниях: суправитальная диагностика и ее клиническое значение

Апоптоз и некроз — два разных механизма (варианта) отмирания индивидуальных клеток тканей, органов человека и животных. Эти варианты характеризуются различными морфологическими и молекулярными явлениями и разным влиянием на окружающие ткани (C.D. Thompson, 1995; A.H. Wyllie с соавт., 1980).

Некроз — наиболее частая неспецифическая форма гибели клеток, запускается преимущественно внешними факторами и является случайным процессом (К.С. Казначеев, 1999). Патологическая гибель клетки (некроз), как правило, происходит в случае, когда клетки подвергаются действию экстремальных факторов (прямая травма, радиация, гипоксия, гипертермия, токсины, литические вирусы и др.) (А.А. Фильченков, Р.С. Стойка, 1999). При некрозе в процесс клеточной гибели вовлекается одновременно большое число клеток. Некроз может инициироваться продуктами распада клеток, а локализация процесса наступает только через развитие воспалительных изменений (Н.Н. Белушкина, С.Е. Северин, 2001).

Некроз обычно начинается с повреждения цитоплазматической мембраны, которое приводит к нарушению способности клеток сохранять свой ионный гомеостаз. Вследствие поступления в клетку избытка молекул воды и ионов из внеклеточного пространства происходит набухание не только клетки, но и некоторых органелл, в первую очередь митохондрий. Из-за разрывов плазматической мембраны содержимое цитоплазмы, включая лизосомальные ферменты, попадает во внеклеточное пространство, вызывая значительные повреждения ткани и развитие воспалительного процесса. Разрушение клетки происходит путем ее лизиса. Биохимические процессы, происходящие во время некроза клеток, не требуют энергии и могут осуществляться даже в условиях низких температур (+4 °С). Морфологические изменения в ядре некротической клетки обнаруживаются не так быстро, как во время апоптоза.

Апоптоз — физиологическая, генетически запрограммированная клеточная смерть, активный процесс самоликвидации («самоубийства») клетки, вызываемый внутренними или внешними сигналами. К экзогенным факторам относят физические (ионизирующее и ультрафиолетовое излучения), химические (оксиданты, токсины и др.) стимулы. К эндогенным — гормоны, цитокины, дериваты арахидоновой кислоты, прямые межклеточные контакты (А.Н. Маянский с соавт., 1997).

В современном понимании термин «апоптоз» был предложен J.F.R. Kerr с соавт. в 1972 г. Термин «запрограммированная гибель клетки» впервые был использован R.A. Lockshin, C.M. Williams в 1965 г. Исследователями 80–90-х гг. ХХ в. установлено, что в клетках организма существует генетическая программа, которая обеспечивает определенный по времени жизненный цикл и при определенных физиологических или патологических условиях включает программу гибели клетки. Было выяснено, что апоптоз является такой же фундаментальной генетической программой, как пролиферация, дифференциация или пребывание клеток в покоящемся состоянии (А.Н. Маянский с соавт., 1997; Г.Н. Дранник, 1999). Путем программированной клеточной гибели происходит удаление клеток, выживание которых нежелательно для организма, например мутантных клеток или клеток, зараженных вирусом. В последнем случае этот процесс имеет важное биологическое значение, поскольку фрагментация ДНК предупреждает перенос генетического материала вируса в другие клетки (Н.Н. Белушина, С.Е. Северин, 2001).

Апоптоз — активный процесс, требующий затрат энергии, транскрипции генов и синтеза белка de novo. Применение ингибиторов этих процессов приводит к ингибированию апоптоза. Аналогичной зависимости в случае некротической гибели клетки нет (J.S. Amenta, F.M. Baccino, 1989; M.K. Bach, 1995).

Наиболее характерными морфологическими изменениями при апоптозе являются: агрегация хроматина, конденсация ядра и цитоплазмы, а также фрагментация ядра и цитоплазмы на покрытые плазматической мембраной везикулы (апоптотические тельца), которые содержат конденсированный ядерный материал, митохондрии и рибосомы. In vivo апоптотические тельца быстро выявляются и подвергаются фагоцитозу макрофагами и соседними эпителиальными клетками. Это удаление апоптотических телец in vivo не сопровождается воспалительным процессом (А.А. Фильченков, Р.С. Стойка, 1999). Во время апоптоза клеток определенного типа отмечается выраженная вакуолизация цитоплазмы.

В отличие от некроза апоптоз встречается не только в патологически измененных, но и в нормальных тканях. У взрослых млекопитающих апоптоз обнаруживается как в тканях с медленной пролиферацией клеток (эпителий протоков печени, простаты, надпочечников), так и в тканях, клетки которых постоянно обновляются (эпителий ворсинок кишечника, клетки крови, сперматогонии).

Апоптоз играет очень важную роль в функционировании иммунной системы (А.Н. Чередеев, Л.В. Ковальчук, 1997). Яркий пример — удаление аутореактивных Т-клеток в тимусе и селекция В-клеток в лимфоидных фолликулах. С помощью апоптоза удаляются стареющие нейтрофильные лейкоциты и мегакариоциты, потерявшие большую часть цитоплазмы во время образования тромбоцитов.

Апоптоз в отличие от некроза является иммунологически инертным процессом, который не вызывает развития воспалительной реакции.

Наиболее характерные свойства некроза и апоптоза представлены в табл. 4.

Все изменения, происходящие в клетке во время апоптоза, можно разделить на 2 фазы:

— фаза обратимых изменений, во время которой процесс апоптоза может быть остановлен и клеточные структуры будут репарированы (Y. Hannum,1997; К.С. Казначеев, 1999);

— необратимая фаза, во время которой клеточные структуры разрушаются и клетка образует апоптотическое тельце (Y. Hannum,1997).

В апоптозе, вызванном действием на клетки бактериальных токсинов, как правило, участвуют нейтрофилы, макрофаги и лимфоциты [62, 69]. Причем лимфоциты необходимы не только для ликвидации поврежденных клеток, но и для разрушения бактериального патогена (J.C. Reed, 1997).

Особый интерес для медицины неотложных состояний представляет суправитальное (прижизненное) изучение типа некробиоза (апоптоза/некроза) лейкоцитов, в частности нейтрофилов, как циркулирующих, так и экссудативных (Н.А. Маянский с соавт., 2000). Нейтрофилы принадлежат к клеткам с наиболее коротким периодом жизни. Они циркулируют в крови около 10 ч и, перейдя в ткани, погибают через 3–5 дней.

По данным А.Н. Маянского с соавт. (1993, 2000); S.C. Frasch с соавт. (1998), усиление апоптоза нейтрофилов вызывают: TNF-α, перекись водорода, гепарин, протеолитические ферменты, сульфосалазин, гипертермия, фагоцитоз бактерий, ультрафиолетовое облучение. По мнению М.Г. Винокурова с соавт. (2001), весьма вероятно, что одним из звеньев лечебного эффекта УФОК может быть ускорение апоптоза нейтрофилов.

Антиапоптозный эффект вызывают IL-1γ, IFN-β, PAF, IL-2, -4, глюкокортикостероидные гормоны, ЛПС грамотрицательных бактерий.

Нейтрофилы способны противостоять не только спонтанному, но и индуцированному апоптозу — IL-8 отменяет апоптогенное действие TNF-α (R. Kettritz с соавт., 1998). IL-10 блокирует антиапоптозное действие IFN-γ, ЛПС, ГМ-КСФ (M. Keel с соавт., 1997). Дексаметазон усиливает задержку апоптоза, индуцированного ГМ-КСФ, но не ЛПС (G. Cox,1995).

Задержка спонтанного апоптоза нейтрофилов наблюдается у больных с септическим синдромом на фоне пневмонии, ожогов и травм (D. Chitnis и соавт., 1996; W. Ertel с соавт., 1998; M.F. Jimmenez с соавт., 1997; M. Keel с соавт., 1997), после полостных операций (M. Keel с соавт., 1997; E. Kobayashi, H. Yamauchi, 1997). Задержка апоптоза, продлевающая жизнь активированных нейтрофилов, может способствовать развитию полиорганных нарушений, типичных для сепсиса (А.Н. Маянский с соавт., 1999).

Факторы, влияющие на апоптоз нейтрофилов, могут возникать при любых стрессовых ситуациях, в том числе под влиянием стимулов, исходящих из очагов воспаления. В плазме больных с ожогами обнаружены ингибиторы апоптоза. Ингибиторы нейтрофильного апоптоза выявлены также в сыворотке больных с септическими посттравматическими (W. Ertel с соавт., 1998; E.R. Goodman с соавт., 1998) и послеоперационными (M.F. Jimmenez с соавт., 1997) осложнениями.

Влияние патологических состояний на апоптоз нейтрофилов может быть опосредовано и через стрессзависимую перестройку гормонального статуса, прежде всего через глюкокортикоидные гормоны, угнетающие апоптоз нейтрофилов (А.Н. Маянский с соавт., 1999).

При ряде вирусных инфекций, в частности при ВИЧ-1, аденовирусной, Эпштейна — Барр, бакуловирусной инфекции, инфицированные клетки защищаются от апоптоза, тогда как гибель неинфицированных клеток иммунной системы может привести к тяжелой иммуносупрессии (Л.В. Ковальчук, А.Н. Чередеев, 1998).

В качестве важного аспекта старения иммунной системы человека наряду с многочисленными факторами следует рассматривать и высокую степень запрограммированной клеточной гибели, в первую очередь Т-лимфоцитов. Вероятно, высок процент апоптоза клеток иммунной системы под влиянием лекарственных препаратов (глюкокортикостероидов, иммунодепрессантов и др.). Применение этих препаратов играет существенную роль в подавлении иммунных процессов при аутоиммунной патологии, но может оказаться фатальным фактором при иммунодефицитных состояниях.

Эти и многие другие факторы позволили выделить в самостоятельную группу иммунодефициты, как первичные, так и приобретенные, в основе которых лежит интенсивный прогрессирующий апоптоз клеток иммунной системы, в первую очередь лимфоцитов (Л.В. Ковальчук, А.Н. Чередеев, 1998).

В настоящее время в клинической практике для оценки апоптоза используют следующие методические приемы:

— морфологический (обычная световая и электронная микроскопия, проточная цитофлюорометрия, лазерная сканирующая цитометрия);

— биохимический с выявлением биохимических изменений в плазматической мембране путем проточной цитофлуорометрии, в цитоплазме и митохондриях путем проточной цитофлуорометрии, спектрофотометрии, флуориметрического анализа, иммуногистохимии и иммуноцитохимии, в ядре путем лазерной сканирующей цитометрии , иммуноферментного анализа (А.А. Фильченков, Р.С. Стойка, 1999).

Существует мнение, что морфологические изменения становятся видимыми при световой микроскопии только с началом необратимых изменений в ядре и цитоплазме (Y. Hannum, 1997; К.С. Казначеев, 1999). Изменения на ранних стадиях можно выявить только с помощью дополнительных (биохимических) лабораторных методик.

Наряду с этим возможно определение жизнеспособности клеток реакцией с трипановым синим. Данный метод технически несложен, но малоинформативен, поскольку исследуемая популяция разделяется на живые и мертвые клетки. Апоптотические клетки вплоть до потери функции мембраны определяются данным методом как живые.

Определение активности лизосомальных ферментов и НСТ-тест также дают только косвенные указания на процессы апоптоза, идущие в клетке. При использовании этих методик невозможно установить причину повышенной активации ферментов и генерации свободных кислородных радикалов (К.С. Казначеев, 1999). Лизосомальные ферменты — маркеры процесса некробиоза. Длительное увеличение активности лизосомальных ферментов, очевидно, является молекулярным признаком синдрома системного воспалительного ответа, в частности прижизненного некробиоза (В.Л. Кожура,1999).

Таким образом, на сегодняшний день существует реальная возможность идентификации клеток иммунной системы, подвергающихся апоптозу. На основании учета апоптотических процессов в лимфоцитах можно сделать заключение о патогенетических механизмах приобретенных иммунодефицитов, устанавливать стадию иммунного дистресс-синдрома при критических состояниях [1, 18, 20, 38, 40].

Уровень коммитированных к апоптозу нейтрофилов и некротически измененных гранулоцитов определяли в венозной крови. Гепаринизированную венозную кровь с добавлением 100 ЕД/мл пенициллина культивировали в термостате при 37 °С. Через 6 ч учитывали коммитированные к апоптозу лейкоциты и некротически измененные гранулоциты путем световой микроскопии в тонких мазках крови, окрашенных по Романовскому — Гимзе (рис. 3). Известно, что результаты морфологического анализа хорошо коррелируют с данными других методов оценки апоптоза (M.-J. Herbert с соавт., 1996; D.A. Moulding с соавт., 1998; J.S. Savill с соавт., 1989).

Показатели у здоровых лиц, принятые в качестве региональной нормы (по данным А.Н. Нестеренко, А.В. Седых, 2004): коммитированные к апоптозу нейтрофилы — 11,20 ± 0,723 ‰; некротически измененные нейтрофилы — 44,80 ± 4,60 ‰.

Диагностическое значение. У выживших больных с тяжелым хирургическим сепсисом мы отметили увеличение в сравнении с нормой числа коммитированных к апоптозу нейтрофилов при незначительном увеличении в сравнении с нормой числа некротически измененных клеток.

У больных с хирургическим сепсисом, получавших на стадиях инициации SIRS и иммунотоксикоза адекватную тяжести состояния интенсивную терапию с иммунокоррекцией (диклофенак, ингибитор TNF пентоксифиллин, анаболизирующие стероиды, индукторы IFN: циклоферон, дипиридамол, амизон; IgN, ВЛОК, УФОК, антибиотики), мы наблюдали увеличение доли коммитированных к апоптозу нейтрофилов в 1,7 раза в сравнении со значением нормы.

Для больных, умерших от СПОН вследствие тяжелого хирургического сепсиса в фазу иммунопаралича, подтвержденного на аутопсии, было характерно уменьшение числа коммитированных к апоптозу нейтрофилов и увеличение доли некротически измененных клеток, что сочеталось со снижением уровня апоптогенных цитокинов: уровень TNF- a был ниже нормы (76,90 ± 3,36 пг/мл) в 2,5–4,7 раза, достигая 16 пкг/мл [1, 18, 20, 38].

Продолжение в следующем номере