Газета «Новости медицины и фармации» 21-22(265-266) 2008

Применение пробиотиков с целью улучшения здоровья человека предлагалось в течение многих лет [1]. Недавно термин «пробиотики» был переопределен как «живые микроорганизмы, которые при применении в адекватных количествах вызывают улучшение здоровья организма-хозяина» [2]. В значительном количестве исследований была продемонстрирована терапевтическая эффективность пробиотиков в лечении нескольких желудочно-кишечных бактериальных расстройств, включая острую диарею, диарею, вызванную приемом антибиотиков, и диарею путешественников [3–5]. Кроме терапевтического применения в качестве лекарственных препаратов в течение последних 20 лет пробиотики интенсивно включались в состав различных пищевых продуктов (особенно кисломолочных).

На сегодняшний день наиболее широко описанными в документальных источниках пробиотиками являются лактобактерии. В противоположность этому механизмы, ответственные за благоприятное воздействие других пробиотиков, особенно представителей вида Bacillus, вплоть до недавнего времени оставались мало изученными. Штаммы Bacillus для лечебного питания животных и для людей (лекарственные препараты) включают B.subtilis, B.lichenformis, B.coagulans, B.toyoi (cereus), B.natto (subtilis), B.clausii, B.polyfermentans и B.cereus [ 6–9 ] .

Многие аспекты, включая безопасность и функциональные характеристики, должны быть рассмотрены во время отбора микроорганизмов для образца пробиотика. Функциональные характеристики включают в себя жизнеспособность и персистенцию в желудочно-кишечном тракте, антагонистические свойства против бактериальной инфекции и иммуномодуляцию. Как утверждалось, антибактериальная активность пробиотических бактерий была одним из пробиотических механизмов ингибирования патогенных микроорганизмов. Более того, несколько авторов ранее сообщали о том, что антибактериальная активность пробиотических бактерий in vitro и in vivo в значительной мере объясняется их способностью продуцировать антибактериальные вещества. Недавние исследования свидетельствуют о том, что антибактериальная активность пробиотиков Lactobacillus включает в себя выработку секретируемых соединений, таких как органическая кислота, перекись водорода, а также различных антибиотиков и/или бактериоцинов [ 10–13 ] . В нашем недавнем исследовании было продемонстрировано, что антибактериальная активность одного из пробиотических штаммов B.subtilis (Biosporin) является результатом выработки 2 разных антибиотиков [ 8 ] .

Кроме того, в нескольких исследованиях было продемонстрировано, что принимаемые перорально пробиотические бактерии могут стимулировать клеточную и гуморальную иммунные системы, что приводит к улучшению состояния здоровья пациентов в случае возникновения кишечных инфекций [ 14, 15 ] . Как сообщалось, пробиотики Bacillus индуцируют клеточный и гуморальный иммунные ответы in vivo [ 16–18 ] . Как показали недавние исследования, при пероральном приеме споры B.clausii являются иммуногенными, обладают тропностью к пейеровым бляшкам и мезентериальным лимфатическим узлам и, вероятно, способны влиять на выработку цитокинов [ 19 ] . Более того, учитывая их иммуномодулирующие свойства, эти бактерии предлагалось использовать в качестве транспортного средства для пероральных вакцин [ 19, 20 ] .

Несмотря на недавние значительные успехи в характеристике пробиотиков Bacillus, молекулярные и клеточные механизмы, влияющие на иммуномодулирующее воздействие этих бактерий, все еще неизвестны.

Как сообщалось, пробиотик Enterogermina^® на основе Bacillus, включающий в себя 4 штамма Bacillus, недавно реклассифицированный с subtilis дo clausii и проявивший низкий уровень внутривидовых разновидностей [ 21 ] , вызывает благоприятные клинические эффекты, особенно при лечении диареи и профилактике инфекционных заболеваний [ 3, 16 ] . Однако точные механизмы, ответственные за эти эффекты, остаются неясными. Целью данного исследования являлся анализ антибактериальной активности штаммов B.clausii и исследование их иммуномодулирующего воздействия с учетом их способности активировать мышиные антигенпредставляющие клетки и субпопуляции T-клеток in vitro.

Maтeриалы и методы

Штаммы бактерий и питательная среда для культур

В данном исследовании использовались 4 пробиотических штамма B.clausii  — O/C, N/R, SIN и T (Enterogermina^®), B.subtilis 3 (Biosporine), B.licheniformis 31 (Biosporine), B.cereus IP 5832 (Bactisubtil), B.cereus NT (Biosubtyl), B.cereus DM-423 (Cereobiogen) и эталонный штамм B.subtilis 168. Штаммы, использовавшиеся в качестве тест-культур в анализе антибактериальной активности, приведены в табл. 1. Штаммы Bacillus культивировались на бульоне Мюллера — Хинтона (MХ) (Лаборатория Дифко (Difco Laboratory), Детройт (Detroit), Мичиган (MI)) или на агаре МХ в течение 24–72 часов при температуре 30 °C. Лактобактерии выращивались на бульоне МРШ (де Maн, Рогоза и Шарп) (Лаборатория Дифко) в течение 24 часов при температуре 37 °C. Другие бактерии, перечисленные в табл. 1, культивировались на среде вытяжки из мозга и сердца (ВМС) (Лаборатория Дифко). Среда ВМС с добавлением 2% NaCl использовалась для культивирования бактерий видов vibrio. Clostridium difficile культивировали на агаре Brucella («Анаэроб Системс», Морган Хилл, Калифорния (Anaerobe Systems, Morgan Hill, CA)) с добавлением 5% дефибринированной овечьей крови. И наконец, мальт-агар использовался для культивирования грибков. Определение процента споруляции штаммов B.clausii, выращенных в различных условиях, проводилось по окрашиванию по Грамму и наблюдениям под микроскопом.

Определение антибактериальной активности

Анализ колонии верхнего слоя агара использовался для выявления пробиотической антибактериальной активности [ 22 ] . Наличие антагонистической активности пробиотических штаммов Bacillus определялось как ингибирование роста тест-культуры вокруг диска Bacillus. Метод диффузии «колодцев» на агаре использовался для анализа антибактериальной активности супернатанта культуры Bacillus, как было описано выше [ 23 ] . Титр антибактериальной активности (единицы активности (ЕА) на миллилитр) определялся как супернатант с наивысшим титром, демонстрирующий ингибирование S.aureus CIP 350 53 156.

Чтобы охарактеризовать антибактериальные вещества, выработанные пробиотическими бактериями, мы проанализировали теплоустойчивость и резистентность к энзимам антибактериальных веществ, присутствующих в культуре супернатанта пробиотических штаммов. Анализы проводились в соответствии с тем, как было указано ранее [ 24 ] . Ферменты (субтилизин, протеиназа K, химотрипсин, проназа, липаза, α-aмилаза и лизозим) использовались в конечной концентрации 1 мг/мл. Анти -S.aureus- активность определялась до и после обработки с применением диффузного метода «колодцев» на агаре.

Оценка иммуномодулирующей активности

Мышиные перитонеальные клетки и клетки селезенки были взяты у женских особей мышей линий Swiss albino и C57BL/6j в возрасте 6–12 недель («Иффа Кредо», Ст. Герма сур л''Абресле, Франция (Iffa Credo, St. Germain sur l''Abresle, France)), как было описано ранее [ 25 ] . Клетки отмывали дважды и ресуспендировали в среде RPMI 1640 («Сигма» (Sigma)) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Сигма» (Sigma)), 2 мM L-глютамата («Сигма» (Sigma)), 2 мМ натрия пирувата («Сигма» (Sigma)), 20 мМ HEPES («Сигма» (Sigma)) и 25 мкг/мл гентамицина (RPMI — телячья сыворотка крови). Мышиные CD4⁺ T-клетки были очищены от клеток селезенки посредством метода селекции магнитных гранул анти-CD4⁺ («Мелтении Биотек», Калифорния (Meltenyi Biotec, CA)).

Общее количество колониеобразующих единиц пробиотических штаммов (5 ´ 10⁵) было добавлено к 5 ´ 10⁵ культур перитонеальных клеток или клеток селезенки. Кокультивирование осуществлялось в 96-луночных чашках. Клетки в лунках инкубировались в течение 72 часов.

Концентрация нитрита (NO^2–), устойчивого окисленного деривата NO, определялась спектрофотометрически при 540 нм с реагентами Грисса, как было описано ранее [ 25 ] .

Выработка IFN- g измерялась в супернатантах мышиных клеток селезенки, подверженных воздействию пробиотических бактерий Bacillus с применением метода ELISA («ФарМинген», Калифорния (PharMingen, CA)) согласно инструкциям производителя.

Анализ пролиферации T-клеток проводился с целью определить, могут ли пробиотические бактерии Bacillus активировать пролиферацию T-клеток в присутствии антигенпредставляющих клеток (АПК). Анализ проводился в 96-луночных чашках, при этом использовались облученные (3300 рад), не подвергавшиеся воздействию клетки селезенки 5 ´ 10⁵ (в качестве АПК) в кокультуре с очищенными CD4⁺ T-клетками 2 ´ 10⁵ в присутствии или в отсутствие пробиотиков Bacillus (5 ´ 10⁵ колониеобразующих единиц/«колодец»). Клетки инкубировались в течение 4 дней при температуре 37 °C, 5% CO₂. За 18 часов до конца кокультивирования клетки были помечены [³H]-тимидином (1 мкКи; «АйСиЭн Фармасьютикалз Инкорпорейтид», Калифорния (ICN Pharmaceuticals Inc., CA)). И наконец, оценивалось включение [³H]-тимидина с использованием сцинтилляционного счетчика («Бэкман Инструмент Инкорпорейтид» (Beckman Instrument Inc.)).

Результаты

Антибактериальная активность

Антагонистическая активность пробиотических штаммов B.clausii (O/C, N/R, SIN и T) анализировалась с применением анализа колонии верхнего слоя агара. В этих экспериментах штаммы S.aureus и Salmonella использовались в качестве тест-культуры. Все тестируемые штаммы B.clausii выявляли противостафилококковую активность, но не анти -Salmonella активность in vitro. Бесклеточный супернатант штамма B.clausii O/C использовался для дальнейшей характеристики выработанных антибактериальных веществ.

Антибактериальные соединения, присутствующие в бесклеточном супернатанте B.clausii O/C, проявили относительно ограниченную активность. Среди исследуемых бактерий ингибировались только грам-положительные биологические виды, включая C.difficile . Не наблюдалось ингибирующего воздействия против грам-отрицательных бактерий и грибов (табл. 1).

Исследование периода действия выработки антибактериальных веществ проводилось, когда штамм O/C выращивался в бульоне MХ. Противостафилоккоковая активность бесклеточного супернатанта наблюдалась во время различных фаз роста (рис. 1). Значительная выработка соединений, проявляющих противостафилококковую активность, началась в середине стационарной фазы роста (35–43 ч роста культуры) и совпадала со споруляцией. Максимальный уровень выработки антибактериальных веществ (74 ЕА/мл) был достигнут, когда показатель споруляции достиг 60 %.

Антибактериальные соединения, представленные в бесклеточном супернатанте, были относительно теплоустойчивыми, так как активность сохранялась после 30 минут инкубации при температуре 85 °C. Более того, бесклеточный супернатант сохранял 60 % противостафилококковой активности после 30 минут нагревания при температуре 95 °C. Обработка бесклеточного супернатанта субтилизином, протеиназой K, химотрипсином, липазой, aльфа-aмилазой или лизозимом не повлияла на его антибактериальную активность, однако при обработке проназой супернатант был инактивирован.

Иммуномодулирующая активность

Чтобы охарактеризовать иммуномодулирующую активность пробиотических штаммов B.clausii, исследовалась способность этих бактерий стимулировать выработку нитрита в перитонеальных мышиных клетках линии Swiss. Концентрации нитритов измерялись в 72-часовых супернатантах кокультуры. Вегетативные клетки штаммов B.clausii индуцировали значительные уровни выработки нитрита (приблизительно 100 uM).

Более того, эти уровни стимулирования были сопоставимы с уровнями, полученными, когда перитонеальные клетки кокультивировались с пробиотическим штаммом B . subtilis 3. Другие тестируемые вегетативные клетки пробиотиков Bacillus (B.licheniformis 31, B.cereus IP 5832, B.cereus NT и B.cereus DM-423) и эталонный штамм B.subtilis 168 имели более низкий стимулирующий эффект (интервал концентрации нитрита 35–75 uM). Это увеличение выработки нитрита было полностью прекращено при добавлении l-N⁶- (имино-этил)-лизин-дигидрохлорида (L-NIL), что свидетельствует о том, что стимулирующий эффект происходил путем индукции NOS II.

Активность NOS II в мышиных АПК можно индуцировать определенными цитокинами, включая INF-γ. Таким образом, мы проанализировали воздействие 4 пробиотических штаммов B.clausii на выработку IFN-γ клетками селезенки мышей линии C57BL/6j с применением метода ELISA. Все 4 штамма продемонстрировали сильное стимулирующее воздействие на выработку IFN-γ, которое было значительно выше, чем воздействие, наблюдаемое в случае с эталонным штаммом B.subtilis 168 (рис. 2).

И наконец, мы проанализировали способность штаммов B.clausii активировать пролиферацию CD4⁺ T-клеток в присутствии АПК. CD4⁺ T-клетки были очищены от клеток селезенки мышей линии C57B l /6j. Чистота этих клеток составляла 96–98 % (проточный цитометрический анализ, данные не приводятся). Все штаммы B.clausii индуцировали значительный пролиферативный ответ Т-клеток (табл. 2). Стимулирующий эффект пробиотического штамма на лимфопролиферацию был сопоставим с полученным эффектом для конканавалина A.

Обсуждение

Идея перорального приема непатогенных микроорганизмов для улучшения здоровья не нова. Однако этой идее вплоть до недавнего времени не уделялось достаточного внимания. Недостаточное признание в медицинской среде было результатом существовавшей ранее нехватки научных доказательств благоприятного воздействия пробиотиков. За последнее десятилетие в клинических исследованиях поддерживалось использование отобранных пробиотических агентов в профилактике и лечении желудочно-кишечных заболеваний [ 26–27 ] . Однако о механизмах, ответственных за эффекты, наблюдаемые в клинической практике, известно немного. Недавние исследования свидетельствуют о том, что пробиотики, вероятно, действуют посредством разнообразных механизмов [ 8, 14, 15 ] . Более того, каждый агент может оказывать уникальное воздействие.

Бактерии вида Bacillus известны как продуценты большого количества бактериоцинов и антибиотиков. Однако об антибактериальных веществах, вырабатываемых пробиотическими штаммами Bacillus, информации немного. Промышленный пробиотик B.polyfermentans SCD, который успешно применялся в лечении долговременных кишечных расстройств, как было описано, вырабатывает polyfermeticin (чувствительный к протеиназе K и лабильный к повышенным температурам бактериоцин) [ 7 ] . Мы также сообщали о том, что пробиотический штамм B.subtilis 3 (Biosporin) вырабатывал как минимум 2 антибактериальных вещества, одно из которых определялось как Amicoumacin A [ 8 ] . Более того, недавно полученные нами данные продемонстрировали, что этот штамм также вырабатывает четыре других антибиотика липопептидной природы (персональная связь). В текущей работе мы продемонстрировали, что все четыре штамма B.clausii, входящие в пробиотик Enterogermina^®, проявляли антибактериальную активность in vitro. Более того, мы определили, что штамм B.clausii O/C вырабатывал как минимум одну антибактериальную субстанцию, выделяемую в среду, выявлявшую активность против грам-положительных бактерий. Эта субстанция характеризовалась как бактериоциноподобная субстанция, так как ее антибактериальная активность была чувствительной к проназе. Однако анализ периода действия выработки вещества продемонстрировал, что это антибактериальное вещество обладало кинетикой выработки вторичных метаболитов в противоположность бактериоцинам, которые рассматриваются как первичные метаболиты. Таким образом, мы не исключаем, что произведенная субстанция может быть антибиотиком полипептидной или липопептидной природы, потому что такие антибиотики, как было описано, часто вырабатываются многими биологическими видами Bacillus [ 7, 8, 23, 26 ] .

Недавно было предложено использовать пробиотики в лечении первичной и рецидивирующей диареи, вызванной С.difficile [ 26, 28 ] . Интересно, что антибактериальное вещество, вырабатываемое штаммом B.clausii O/C, проявляло активность в отношении исследуемых штаммов С.difficile. Этот наблюдаемый in vitro анти- C.difficile- эффект открывает перспективы для получения пользы от применения Enterogermina^® в лечении диареи, вызванной C.difficile.

Tочные механизмы, посредством которых пробиотики улучшают иммунную защиту организма-носителя и служат промежуточным звеном в защите, в полной мере неизвестны. Существуют доказательства того, что пробиотики также могут улучшать здоровье организма-носителя, стимулируя в нем как специфические, так и неспецифические иммунные ответы. Многочисленные исследования, касающиеся иммуномодулирующих свойств штаммов лактобактерии, недавно были опубликованы [ 14, 15 ] . В отношении пробиотиков Bacillus информации имеется немного. Утверждалось, что образование нитрита в результате активности NOS II может быть задействованным в балансе T_H1/T_H2 [ 29 ] . В нашем исследовании все исследуемые пробиотические Bacillus вызывали экспрессию NOS II и впоследствии — выработку нитрита в макрофагах после кокультивирования бактерий с мышиными перитонеальными клетками. Это индуктивное влияние NOS II было непрямым, так как не наблюдалось выработки нитритов в кокультуре бактерий с очищенными макрофагами или линией клеток J774,2 (данные не приводятся).

Иммуномодулирующую активность лактобактерии можно объяснить, в частности, задействованием сети цитокинов, которая играет основную роль в координации иммунной функции [ 30, 31 ] . Мусцеттола (Muscettola) и др. [ 17 ] продемонстрировали, что введение пробиотика Enterogermina^®, содержащего 4 штамма B.clausii, у мышей увеличило выработку IFN ex vivo . Наше исследование продемонстрировало, что in vitro каждый из этих 4 пробиотических штаммов B.clausii стимулировал выработку IFN-γ клетками селезенки мышей. Более того, все эти штаммы вызывали пролиферацию клеток CD4⁺ мышей в присутствии облученных АПК. Иммуномодулирующая способность этих штаммов может быть результатом экспрессии некоторых внеклеточных и/или связанных с клеточной стенкой соединений, участвующих в иммуностимуляции [ 32 ] . Идентификация соединений, ответственных за иммуностимулирующую способность пробиотических штаммов B.clausii, в настоящее время исследуется.

Наши результаты свидетельствуют о том, что наблюдаемые благоприятные клинические эффекты Enterogermina^® могут как минимум частично быть результатом антибактериальной и иммуномодулирующей активности пробиотических штаммов B.clausii. Эти наблюдения позволяют понять суть механизмов, ответственных за пробиотические эффекты Bacillus на организм-носитель, и должны стать стимулом к дальнейшим исследованиям для достижения понимания физиологии взаимодействия этих бактерий с организмом-носителем и роли различных соединений, вырабатываемых пробиотическими микроорганизмами.