Международный неврологический журнал 2(6) 2006

Введение

Известно, что по составу нейротрофики природного происхождения многокомпонентны и до конца не изучены. Исследования показали, что Церебролизин^®, актовегин, экстракт Гинкго Билоба и другие нейропротекторы природного происхождения — значительно более сложные нейроактивные комплексы, чем это принято думать [1-3, 6, 12]. Препарат Церебролизин^® содержит эссенциальные микроэлементы (Se, Zn, Li, Co, Mn, V и т.д.) в комплексе с аминокислотами и нейропептидами [13]. Доказана способность препарата ингибировать образование ОН-радикалов при экспериментальной ишемии [24]. Церебролизин^® защищает митохондрии нейронов от повреждающего воздействия лактатацидоза, проявляет высокую общую активность супероксиддисмутазы (СОД) in vitro [3] и in vivo [12], улучшает спраутинг нейронов [1], на молекулярном уровне ингибирует процесс гиперактивации калпаина, Са²⁺-зависимой сериновой протеазы, играющей одну из ключевых ролей в патогенезе ишемического инсульта. Использование высоких технологий при изготовлении позволяет сохранять в нейротрофических препаратах не только эссенциальные элементы [11, 13, 15], активность антиоксидантных ферментов [3], но и витаминную активность [2].

Церебролизин^® (FPF-1070) (EBEWE Pharma, Австрия), полученный из коркового вещества мозга свиней, содержит низкомолекулярные биологически активные нейропептиды с молекулярным весом, не превышающим 10 000 дальтон (15%), проникающие через гематоэнцефалический барьер, свободные аминокислоты (85%) [12]. Церебролизин^® стандартизирован по аминокислотному составу, в то время как состав олигопептидов и мембранной фракции пептидов Церебролизина^® не достаточно изучен.

Цель. Выделить мембранную пептидную фракцию Церебролизина^®; определить молекулярные массы пептидов в составе препарата; провести сиквенирование и установку по базам белков наиболее устойчивых олигопептидов и мотивов.

Материалы и методы

Объект исследования — раствор препарата Церебролизин^® (FPF-1070) фирмы EBEWE Pharma, Австрия. Исходный препарат Церебролизин^® содержит значительное количество фосфолипидов и солей, поэтому для их удаления был проведен ряд обработок. Для выделения и последующей очистки препарата от мембранной фракции и фосфолипидов использовался модифицированный метод Брокерхоффа — Даусона — Хюбшера — мягкое щелочное дезацилирование фосфолипидов [5]. Методику отрабатывали на модели в смеси 1 мл протеолипосом из 1-20 мг фосфатидилхолина и 0,05-0,2 мг бацитрацина или грамицидина А. 1 мл Церебролизина^® лиофилизовали, доливали смесь гексана с метанолом (1 : 1, v/v) и разводили в 2 раза 0,25 М NaOH в метаноле. 45 мин инкубировали при встряхивании при комнатной температуре, включая 15 мин при t = 75°C. Последовательно приливали метанол, гексан и воду (1 : 4 : 4, v/v), перемешивали и центрифугировали 1 мин при 1000 g. Фракцию с гексаном отсасывали, водно-метанольную — нейтрализовали HCl до pH 4-6. К нейтрализованной водно-метанольной фракции добавляли гексан, перемешивали, центрифугировали 1 мин при 1000 g, осторожно отсасывали фракцию с гексаном, не затрагивая осадок на границе раздела фаз. Повторяли процедуру 4 раза. Водно-метанольную фракцию объединяли, лиофилизировали, осадок ресуспендировали сначала в смеси метанол : вода (1 : 1), супернатант отливали, затем в смеси хлороформа с метанолом (1 : 1), 0,2% ТФУ, супернатанты объединяли, высушивали от хлороформа и обессоливали. Удаление фосфолипидной фракции из Церебролизина^® позволило получить очищенный объект (Церебролизин-1) для последующего исследования пептидной фракции. Далее проводили обессоливание пептидов на мини-колонке при помощи центрифугирования [4]. В мини-колонку 0,75 х 4,5 см («Raining Instrument», США, 2000) наливали 2 мл сефадекса G-10, декантированного в смеси метанола с водой (85 : 15, v/v), каплями наливали 160 мкл того же раствора и уравновешивали на центрифуге 1 мин при 1000 g. Процедуру повторяли до тех пор, пока на выходе не осталось 150 мкл раствора. 160 мкл образца каплями наносили на гель и центрифугировали, как описано выше. Гель после однократного использования заменяли. Объект исследования после процедуры обессоливания условно назвали Церебролизин-2. Затем проводили хроматографическое разделение компонентов Церебролизина-2 при следующих условиях хроматографии. Использовали колонку Диасорб С16Т, Элсико, Россия, 2003. Элюент: буфер А — 5% MeCN в воде, 0,1% ТФУ, буфер В — 95% MeCN в воде, с 0,1% трифторуксусной кислотой (ТФУ). Скорость потока — 0,8 мл/мин при 20°С. Объем образца — 50-1000 мкл. Снимали спектры поглощения при 214 нм и флуоресценции Em = 300 нм при Ex = 210 нм. Использовалось оборудование: высокоэффективный жидкостный хроматограф (ВЭЖХ) Agilent 1100, снабженный ультрафиолетовым и флуоресцентным детекторами, а также вакуумный концентратор-лиофилизатор (Savant, 2000), масс-спектрометр (Bruker Reflex IV, 2002), реактивы и растворители фирм Sigma и Merck. Молекулярные массы пептидов и белков определяли методом MALDI-TOF [14, 16].

Также было проведено исследование Церебролизина^® на системе белковых чипов с масс-спектрометрической детекцией (SELDI-TOF) PBS II. Спектры масс экстракта Церебролизина^® получали посредством SELDI-MS с использованием ProteinBioSystem™ II (Ciphergen, США). По 2 мкл препарата, разбавленного деионизованной водой до концентрации 2 мг/мл, наносили на чип NP20 с нормальной фазой, отмывая по инструкции производителя (Ciphergen). Спектры получали в диапазоне 1000-10 000 Да и в диапазоне 6000-20 000 Да с использованием в качестве матрицы α-цианогидроксикоричной кислоты (Sigma, США). Спектры масс докалибровывали с использованием уравнений внешней калибровки.

Определение N-концевой аминокислотной последовательности проводилось на приборе Protein/Peptide Sequencer (модель 477A) фирмы Applied Biosystems (США). Идентификация ФТГ-аминокислот проводилась на анализаторе 120A PTH Analyzer фирмы Applied Biosystems (США). В основе методики автоматического определения аминокислотной последовательности пептидов и белков лежит метод химической деградации полипептидной цепи, разработанный Эдманом [9], что позволяет последовательно отщеплять N-концевые аминокислотные остатки в виде фенилтиогидантоинов (ФТГ) и идентифицировать отщепленные ФТГ-аминокислоты методом ВЭЖХ. Модели полученных молекул построены с использованием специального пакета программ «HyperChem 7.01».

Результаты и их обсуждение

Мягкое щелочное дезацилирование Церебролизина^® по модифицированному методу Брокерхоффа — Даусона — Хюбшера [5] показало существенное присутствие в препарате липидной фракции. Церебролизин^® содержит фосфолипиды и, предположительно, ганглиозиды. Ганглиозиды, как и все гликосфинголипиды, состоят из двух частей: гидрофобной, находящейся вне нервных клеток, и гидрофильной, входящей в состав плазматической мембраны [10]. При тестировании Церебролизина^® были последовательно удалены и гидрофобные, и гидрофильные части липидов. Ганглиозиды широко предствлены именно в плазматической мембране нейронов и максимально концентрируются в области синапсов, обеспечивая синаптическую пластичность; они имеют самостоятельный нейротрофический компонент, повышают активность факторов роста нервной ткани [18]. Липиды мозга, и особенно ганглиозиды, регулируют в нейронах обмен электролитов (H+, Na+, K+, Cl-). Ганглиозиды в низких дозах активируют транспорт Na⁺ и K⁺ в нейронах, в высоких дозах — угнетают. При повреждении нейронов активность Na+-K+-аденозинтрифосфатазы снижается [10] и дотация низких доз ганглиозидов желательна.

Хроматографическое разделение компонентов Церебролизина^® представлено на обзорной хроматограмме (рис. 1). Разделение препарата свидетельствует о том, что Церебролизин-2 содержит три группы соединений, которые условно можно обозначить как гидрофильную (время удерживания (RT) < 5 мин, рис. 1), нейтральную (RT от 5 до 20 мин) и липофильную (RT > 20 мин). Разделение компонентов двух последних групп было эффективным, а для лучшего разрешения пиков гидрофильной группы были подобраны параметры хроматографии: термостатирование (20°С) и ломаный градиент элюции, 0-30% В (30 мин), до 100% В (50 мин). В этих условиях фракции 1-10 (рис. 2) собирали, концентрировали с помощью вакуумного концентратора и анализировали.

Из рис. 2 видно, что пептиды фракций 4-7 (8), возможно, содержат триптофан, пептиды фракций 9-10 — не содержат.

Как видно из табл. 1, все фракции препарата Церебролизин^® содержат пептиды. Метод MALDI-TOF не позволяет определить количественное содержание пептидов, однако просматривается определенная закономерность: с увеличением номера фракции (увеличение % MeCN в элюирующем хроматографическом буфере) растут молекулярные массы пептидов.

По данным MALDI-TOF, Церебролизин^® содержит множество пептидов массой в основном до 3 kDa. При исследовании Церебролизина^® на системе белковых чипов с масс-спектрометрической детекцией выявлены пептиды до 5800 Да (рис. 3).

Сиквенс аминокислот в выделенных фракциях олигопептидов Церебролизина^® выявил множество коротких 3-6 аминокислотных остатков, исходно полученных путем трипсинолиза из протеома мозга свиньи. Регуляторные пептиды — типичный продукт при проведении многоступенчатого гидролиза. Они содержат от 5 до 20 аминокислотных остатков. Mолекулярная масса обычно менее 6000 Da [1, 8, 17]. Следует отметить, что олигопептиды и мотивы белков, выделенные из Церебролизина^®, утрачивают видоспецифичность. После идентификации аминокислотной последовательности было проведено пространственное моделирование полученных соединений.

Наиболее важным результатом исследования явилось обнаружение в образцах Церебролизина^® тиролиберина, глутатиона, а также мотивов (повторяющихся характерных сочетаний аминокислот в исходном белке) коллагена и энкефалинов. В Церебролизине^® идентифицирован трипептид тиролиберин с последовательностью аминокислот Glu-His-Pro, антагонист опиоидной активности. Основная функция олигопептида — усиление выделения тиротропина передней доли гипофиза, а также стимуляция ростового гормона кортикотропина [1, 7]. Из Церебролизина^® выделен трипептид глутатион Glu-Cis-Gly (GSH). Глутатион — широко распространенный олигопептид организма человека, присутствует во всех тканевых образованиях, в надпочечниках, эритроцитах, цереброспинальной жидкости, мозге, хрусталике глаза. Наиболее важная функция — участие в окислительно-восстановительных реакциях; используется как донор и акцептор кислорода и необходим для работы большого числа ферментов. Одна из важнейших функций глутатиона в организме — поддержка ключевых белков организма и аскорбиновой кислоты в восстановленном состоянии. Это жизненно важно для обеспечения целостности эритроцитов и прозрачности хрусталика глаза. Из очищенных от липидов образцов Церебролизина^® выделен мотив энкефалина с последовательностью аминокислот Tyr-Gly-Gly-Phе. Энкефалины относятся к пептидам с широким диапазоном действия в центральной и периферической нервной системе. Доказана способность энкефалинов вместе с другими пептидами регулировать болевую чувствительность, половое поведение, мотивацию удовлетворения, адаптационные процессы [17]. Энкефалиновый мотив при соединении с лейцином — это лейцин-энкефалин H-Tyr-Gly-Gly-Phе-Leu-OH, при соединении с метионином — метионин-энкефалин H-Tyr-Gly-Gly-Phе-Met-OH. Лейцин-энкефалин участвует в регуляции многочисленных соматических функций, в контроле поведенческих реакций [1, 7, 17]. Оба этих пептида имеют высокое сродство с d- и m-рецепторами морфинового (опиоидного) типа; именно они дали впервые основание для введения термина «нейропептиды» [1].

В Церебролизине^® обнаружен устойчивый коллагеновый мотив Gly-Pro-Hyp опорных белков мозга. Идентификация коллагенового мотива в препарате не удивительна, т.к. белки коллагеновой группы составляют до 30% от всего объема общего протеома и протеома мозга в частности. Мотив может использоваться для реконструкции поврежденных и для синтеза новых опорных коллагеновых и других белков нейронов и глии.

Выводы

1. В Церебролизине^® официально выделяют активную фракцию. Она состоит из сбалансированной и стабильной смеси аминокислот (85%) и биологически активных нейропептидов (15%), обладающих суммарным полифункциональным действием. Однако состав Церебролизина^® более сложный. Во-первых, проведенные исследования показали, что в очищенном Церебролизине^® присутствуют более 100 олигопептидов и мотивов белков с массой в основном до 5800 дальтон; это многочисленные короткие сочетания аминокислот, фрагменты пептидов, полученные при трипсинолизе протеома коры головного мозга свиней. Они представляют собой потенциальный для метаболизма нервных клеток трофический продукт.

2. Важным итогом исследования явилось обнаружение в составе Церебролизина^® жизненно важных для нейрохимии мозга олигопептидов. Это трипептиды — глутатион Glu-Cis-Gly и тиролиберин Glu-His-Pro, а также мотивы энкефалина Tyr-Gly-Gly-Phе и коллагена Gly-Pro-Hyp.

3. При очистке препарата нами выявлена неизвестная ранее мембранная фракция липидов, которая требует отдельного изучения, так как высоковероятно, что эффекты Церебролизина^®, связанные с повышением пластичности нейронов, могут опираться в своем действии не только на мембранную фракцию пептидов, но и на гетерогенную фракцию нейронспецифичных липидов.