Журнал «Медико-социальные проблемы семьи» 4 (том 18) 2013

Статья опубликована на с. 40-45

Імплантація бластоцисти є абсолютною умовою репродукції людини. Складність цього процесу обумовлена, з одного боку, тим, що ембріон є наполовину чужерідним для материнського організму і є напівалогенним трансплантантом; з іншого боку, тим, що рецептивність ендометрія жінки до імплантації бластоцисти обмежена коротким часовим проміжком — вікном імплантації. Процес імплантації можна розділити на чотири етапи: апозиція, адгезія, інвазія й васкуляризація. У людському виді успішність репродукції обмежена. Навіть у клініках IVF, де допоміжні репродуктивні технології (ДРТ) використовуються для лікування безплідних пар, імплантація є обмежуючим чинником [1]. Для успішної імплантації ембріон повинен досягти стадії бластоцисти в момент рецептивної стадії розвитку ендометрія. Двонаправлений зв’язок між ембріоном та ендометрієм включає молекули адгезії, цитокіни, клітки імунної системи. Механізми толерантності місцевого ендометріального імунітету матері до напівалогенного ембріона до кінця не вивчені. Клітки трофобласта не експресують класичні антигени (А­ і В­молекули) I класу великого комплексу HLA гістосумісності, але експресують класичні молекули С і некласичні G­молекули I класу HLA. У процес імплантації залучені маткові природні клітини — кілери, дендритні клітини й регуляторні Т­клітини. Незважаючи на всі зусилля, не всі бластоцисти високої якості імплантуються з причин, які не досить добре вивчені на сьогодні. Найвища частота імплантації високоякісної бластоцисти в програмі ДРТ становить близько 60 %.

Важливим поняттям сучасної репродуктології є звична неефективна імплантація (ЗНІ) (Recurrent implantation failure). Під цим терміном розуміють нездатність досягти клінічної вагітності при ембріотрансфері (ЕТ) принаймні чотирьох ембріонів у трьох свіжих чи кріоциклах, у яких ембріони гарної якості були перенесені жінкам віком до 40 років [2].

Мета дослідження: оцінка ендометріального фактора в пацієнток із ЗНІ при наявності ембріонів гарної якості.

Матерали та методи дослідження

Робота виконувалася протягом 2011–2013 рр. у Донецькому національному медичному університеті ім. М. Горького на базі кафедри акушерства, гінекології та перинатології ННІПО, Інституту репродуктивної медицини, ДУ «Інститут педіатрії, акушерства і гінекології НАМН України», Медичного центру ІГР.

Основну групу (ОГ) становили 105 жінок, які звернулися для лікування безплідності за методами ДРТ. Критерієм включення були неефективні цикли ДРТ в анамнезі при наявності ембріонів доброї якості. Виконувалося гістологічне, імуногістохімічне дослідження та скануюча електронна мікроскопія (СЕМ) біоптатів ендометрія. Забір матеріалу виконувався пайпелем.

Гістологічне дослідження матеріалу виконували після фіксації формаліном на парафінових зрізах із забарвленням гематоксилін­еозином і за Ван Гізоном. Оцінювали мітотичну активність залоз, строми, наявність вакуолей у клітинах епітелія, стан просвіту залоз, наявність секреції, діаметр, наявність псевдостратифікації епітелія залоз, пропорцію залоз і строми, стан судин строми, наявність предецидуальної реакції, набряку строми, форми епітеліальних клітин. Розрізняли нормальний, атрофічний і гіперпластичний ендометрій, десинхронізацію розвитку залоз та строми. Для характеристики нормального ендометрія використовували критерії Noyes зі співавт. [3–5].

Скануюча електронна мікроскопія. Вивчення маркерів вікна імплантації (ВІ) проводилося у середній лютеїновій фазі циклу замісної гормональної терапії, після десенситизації гіпофіза Аг­ГнРГ. Перший день призначення прогестерону (П) позначався як П1. Перші ознаки синтезу прогестерону яєчників виявляються приблизно через добу після введення овуляторної дози хоріонічного гонадотропіну (ХГ), тому ми вважали день П1 заступного циклу циклу відповідним ЛГ1 стимульованого циклу. Усім жінкам проводилася подвійна біопсія в лютеїновій фазі на ЛГ/П + 6/7 та ЛГ/П + 8/9 днів.

Біопсійний матеріал ендометрія відмивався від крові у фізіологічному розчині. Для ідентифікації піноподій використовували метод скануючої електронної мікроскопії. Біопсійний матеріал фіксувався 24 години в 1,25% розчині глютарового альдегіду на фосфатному буфері, дегідратувався у зростаючих концентраціях спирту (від 50 до 96 %), висушувався методом переходу критичної точки, покривався золотом (150–200 А) [6]. СЕМ проводилася на мікроскопі JEOL Super probe 733 із збільшенням у 2000 разів [7].

Контрольну групу (КГ) становила 21 пацієнтка програми сурогатного материнства, у яких в анамнезі були хоча б одні нормальні пологи; були відсутні скарги на запальні захворювання органів малого таза, порушення менструальної функції. Гістероскопію та біопсію ендометрія цим жінкам виконували під час комплексного обстеження при підготовці до сурогатного материнства. Усі ці жінки надалі мали маткову вагітність, що закінчилася народженням життєздатних дітей. КГ була адаптована за віковим складом до жінок ОГ.

Результати та обговорення

УЗД жінок обстежених груп показало наступне (табл. 1).

Гіпоплазія ендометрія була виявлена в 66 (62,86 %) пацієнток ОГ. Невідповідність ехографічної структури ендометрія дню менструального циклу (МЦ) спостерігалась у майже кожної другої пацієнтки ОГ (49 (46,67 %)) та лише в 1 (4,76 %) випадку серед жінок КГ (р < 0,05). Внутрішньоматкові сінехії спостерігалися в 11 (10,48 %) пацієнток ОГ, у жодному випадку — у КГ. Аномалії розвитку матки були в кожної третьої пацієнтки ОГ (31 (29,52 %)), поміж них аркуатна чи дворога матка була в 28 (26,67 %), однорога матка — у 3 (2,86 %). Міома матки різної локалізації діагностована у 24 (22,86 %) пацієнток ОГ, у 4 (3,81 %) із них була консервативна міомектомія. Наявність гормонозалежної патології та аномалій розвитку була протипоказанням для включення жінок у КГ.

При дослідженні біоптату ендометрія (морфологічні, імуногістохімічні методи) відхилення виявлені у переважної більшості пацієнток ОГ (101 (96,19 %)) та лише в 1 (4,76 %) випадку в КГ (р < 0,05) (табл. 2).

За даними морфологічного дослідження відповідність структури едометрія фазі МЦ спостерігалась у 66 (62,86 %) пацієнток ОГ та у 20 (95,24 %) — КГ (р < 0,05). Дисхроноз між розвитком залоз та строми спостерігався в кожної третьої пацієнтки ОГ (37 (35,24 %)) та в 1 (4,76 %) — КГ (р < 0,05).

Хронічний ендометрит (ХЕ) був у 67 (63,81 %) пацієнток ОГ, із яких у 41 (39,05 %) були виявлені такі прояви ХЕ, як фіброз, склероз строми, ущільнення та склероз судин ендометрія. Число клітин маркерів ХЕ — плазматичних клітин (СD138/Сіндекан 1) на 1000 клітин строми становило 6,14 ± 0,69 з розрахунку на всіх пацієнток ОГ та 7,68 ± 0,77 — на жінок із ХЕ.

Дефіцит фази проліферації, гіпоплазія, гіпотрофія ендометрія були діагностовані в 40 (38,10 %) пацієнток ОГ, вогнищева гіперплазія ендометрія — у 24 (23,08 %), поліпи ендометрія — у 44 (41,90 %), субмукозна міома матки — у 6 (5,71 %). Наявність гормонозалежної патології, ХЕ, гіпотрофії ендометрія було протипоказанням для включення жінок у КГ, тому в цій групі вищеперерахована патологія не визначалась.

СЕМ ендометрію жінок обстежених груп дозволила виявити таке. Поверхневий епітелій ендометрія складається з двох різних типів клітин, що відрізняються при СЕМ: секреторні та циліарні клітини. Морфологія циліарних клітин особливо не змінюється під час циклу. У той же час секреторні клітини, вкриті мікроворсинками, під впливом гормонів формують структури­піноподії. Розвиток піноподій абсолютно прогестеронзалежний і чітко збігається з ВІ. Піноподії зникають при призначенні препаратів з антипрогестероновим ефектом. Високі дози естрогенів пригнічують формування піноподій та порушують імплантацію. Дослідження ультраструктури ендометрія — перспективний маркер його рецептивності [8–11].

У нашому дослідженні при проведенні СЕМ на фоні десенситизації гіпофіза Аг­ГНРГ та ЗГТ на шостий день призначення прогестерону (П + 6) у 68 (64,76 %) пацієнток ОГ була картина «до початку розвитку» — піноподіальні структури не визначались (рис. 1).

У КГ біоптатів з відсутністю піноподій на день (П + 6) не було. Картина «до початку росту» та мізерні піноподії навколо устя залоз спостерігались у 9 (8,57 %) пацієнток ОГ та в 1 (4,76 %) — КГ (р > 0,05). Рясні піноподії, що розвиваються, відповідно в 17 (16,19 %) та в 14 (66,67 %) пацієнток порівнюваних груп (р < 0,05), а піноподії, що розвиваються, та поодинокі розвинені — в 11 (10,48 %) та в 6 (28,57 %) (р < 0,03) (рис. 2).

Труднощі інтерпретації результатів СЕМ унаслідок надмірної кількості еритроцитів були в 1 (0,95 %); унаслідок формування плівки — у 3 (2,86 %) пацієнток ОГ. Циліарні клітини в терміні (П + 6) були виявлені в кожної третьої пацієнтки ОГ (32 (30,48 %)) та вдвічі рідше — у КГ (3 (14,29 %), р < 0,13). Ділянки відсутності при наявності піноподіальних структур виявлялись у 17 (16,19 %) пацієнток ОГ та у 3 (14,29 %) пацієнток КГ (р > 0,05).

На восьмий день призначення прогестерону (П + 8) піноподії були відсутні в 19 (18,10 %) пацієнток основної групи; мізерні піноподії, що розвиваються навколо устя залоз, — у 20 (19,05 %); помірні піноподії, що розвиваються, — у 18 (17,14 %). У КГ біоптатів з відсутністю піноподіальних структур, мізерних піноподій, що розвиваються навколо устя залоз, та помірної кількості піноподій, що розвиваються, на день Р (+8) не було. Рясні піноподії, що розвиваються, спостерігались у 14 (13,33 %) пацієнток основної групи та в 1 (4,76 %) — КГ (р > 0,05). Рясні піноподії, що розвиваються, та поодинокі розвинені спостерігались у 4 (3,81 %), а ділянки з мізерною кількістю піноподій у стадії регресу були у 8 (7,62 %) пацієнток основної групи. Ділянки з помірною кількістю піноподій у стадії регресу були в 13 (12,38 %) пацієнток ОГ та у 2 (9,52 %) – КГ (р > 0,05). Поєднання рясних ютеродомів, що регресують, та поодиноких повністю розвинених піноподій – у 6 (5,71%) пацієнток ОГ та в КГ — у 9 (42,86 %) (р < 0,05). Значний регрес — відповідно у 4 (3,81 %) та в 9 (42,86 %) пацієнток порівнюваних груп (р < 0,05).

Таким чином, при аналізі ендометріального фактора в жінок із ЗНІ найчастіше спостерігалися: дисхроноз розвитку залоз та строми, ХЕ, дефіцит фази проліферації, гіпоплазія, гіпотрофія ендометрія, вогнищева гіперплазія, поліп ендометрія.

Порушення гістологічної структури ендометрія було одним із факторів, що погiршують рецептивнiсть ендометрiя. Найчастіше зустрічались різні клініко­морфологічні прояви ХЕ (63,81 %). Персистенція бактеріальної та вірусної інфекції супроводжується розвитком з’єднувального процесу, порушенням гемодинаміки маткових судин, ушкодженням рецепторного апарату ендометрія з порушенням його морфофункціональної структури, порушенням синтезу молекул імплантації, підвищенням синтезу прозапальних цитокінів. ХЕ характеризується вогнищевими запальними ущільненнями слизової оболонки матки, локалізованними в ділянці залоз та кровоносних судин. Тривалість та ускладнений перебіг запального процесу призводять до склеротичних змін судин та фіброзу. Ці зміни порушують здатність ендометрія відповідати на гуморальну регуляцію, унаслідок чого порушується перебіг циклічних процесів. Невідповідність структури ендометрія хронологічному дню МЦ, дисхроноз між розвитком залоз та строми спостерігався у 35,24 % пацієнток із ЗНІ. Наслідком хронічного запального процесу є також поява поліпів, які були виявлені в 41,90 % пацієнток, та гіпоплазії ендометрія (38,10 %). Указані зміни порушують рецептивність ендометрія до імплантації ембріонів. При прогнозуванні ймовірності настання вагітності, яка закінчиться пологами, за даними прогностичної моделі ефективності лікування безплідності за методами ДРТ, відхилення від норми морфофункціональної структури ендометрія зменшують ефективність лікування на 6,3 бала, а наявність нормальної структури ендометрія покращує прогноз на 1,2 бала [12].

Важливою ланкою патогенезу ЗНІ при наявності ембріонів гарної якості є дані, отримані при аналізі СЕМ. Якщо зважити на те, що імплантація бластоцисти відбувається приблизно на 120­ту годину розвитку ембріона, день наступний після введення тригерної дози ХГл відповідає дню початку синтезу прогестерону — день ЕТ (П + 6) повинен характеризуватись наявністю піноподій, що розвиваються, чи повністю розвинених піноподій; у день (П + 8) повині виявлятись розвинені піноподії та ютеродоми на різних стадіях регресу.

При проведенні СЕМ у день (П + 6) у 73,3 % пацієнток із ЗНІ в анамнезі піноподіальні структури були відсутні чи спостерігалася мізерна кількість піноподій на початку розвитку навколо устя залоз. На день (П + 8) повна відсутність ютеродомів або мізерні піноподіїї, що розвиваються навколо устя залоз, спостерігались у 37,2 % пацієнток. Різні прояви регресу ютеродомів на день (П + 8) спостерігалися лише у 29,52 %. Окрім хронологічних відхилень формування піноподій виявлено значні зміни їх кількості. У пацієнток із ЗНІ ділянки відсутності формування ютеродомів при наявності піноподіальних структур на різних стадіях розвитку виявлялися у 16,19 % у біоптатах (П + 6) та в 19,05 % (П + 8). У пацієнток із нормальною рецептивністю ендометрія біоптатів з відсутністю піноподіальних структур або мізерних піноподій, що розвиваються навколо устя залоз, на дні П (+6; +8) не було. Виявлене відставання формування піноподій та зменшення їх кількості і розмірів є однією з причин порушення імплантації у пацієнток із ЗНІ.

Корекція виявлених морфофункціональних відхилень стану ендометрія та вдосконалення стратегії ЕТ у жінок із ЗНІ в анамнезі є основою підвищення частоти імплантації в цієї категорії пацієнток.

Численні публікації свідчать, що КОС може призвести до зниження рецептивності ендометрія [13]. Зокрема, можливе передчасне дозрівання ендометрія та його асин­хронний розвиток по відношенню до ембріона, що розвивається in vitro. Ми не спостерігали в наших пацієнток із ЗНІ передчасного розвитку ендометрія, навпаки, виявлена затримка його розвитку. Ембріони можна піддати кріоконсервації для того, щоб виконати ембріотрансфер у природному циклі з адекватнішою рецептивністю ендометрія. Нарешті, було показано в моделі імплантації in vitro, що рецептивний ендометрій здатний проводити селекцію ембріонів гарної якості і відхиляти некомпетентні ембріони. Цей процес може бути порушений у пацієнток iз невиношуванням вагітності.

Основна причина відсутності імплантації — низька якість ембріонів, що виявляється фрагментацією, затримкою розвитку, мультинуклеарними і хромосомними порушеннями. Упродовж останніх десятиліть основні зусилля були спрямовані на поліпшення результатів ДРТ шляхом оптимізації умов культивування ембріонів. Стратегія СЕТ для профілактики багатоплідної вагітності спонукала ембріологів шукати додаткову інформацію про потенціал імплантації ембріонів. Це було досягнуто шляхом подовження культивування ембріонів до стадії бластоцисти, морфологічної оцінки якості ембріонів методом time lapse, поліпшення метаболізму фолікулярної рідини й культуральних середовищ.

Рецептивність ендометрія залежить від його росту та секреторної трансформації. Естрогени, які виділяються під час фолікулогенезу, підтримують зростання ендометрія й забезпечують підготовку ендометрія до процесу децидуалізації під впливом прогестерону у постовуляторному періоді.

До недавнього часу діалог «ембріон — ендометрій» розглядали як вторгнення активного ембріона в пасивний ендометрій. Проте дослідження останніх років показали, що децидуалізація ендометрія виступає як біосенсор якості ембріонів, відбувається зниження цитокінової відповіді ендометрія в присутності ембріона поганої якості. Децидуалізація ендометрія краща при наявності ембріонів високої якості і гірша в присутності ембріонів поганої якості. У лабораторних умовах показано, що ця нещодавно описана ембріон­селективна функція ендометрія порушена в жінок із звичним невиношуванням (ЗН). У стромальних клітинах ендометрія цих жінок зменшена експресія маркерів децидуалізації, пролактину та IGFBP1. Окрім того, міграція стромальних клітин змінена в жінок із ЗН. Незважаючи на те, що етіологія звичних невдалих імплантацій часто вважається аналогічною ЗН, децидуальні фенотипічні аномалії в кожному стані насправді можуть бути протилежними. Іншими словами, ЗНІ можуть виникнути через те, що більш селективний ендометрій дозволяє імплантуватись тільки найкращим ембріонам. У той час ЗН виникає через відсутність селективності ендометрія, що дозволяє імплантуватись ембріонам із низькою життєздатністю, що пізніше призводить до мимовільного аборту чи вагітності, що не розвивається [1]. Клінічну значимість цих результатів ще належить уточнити, але зростаюче число доказів підтверджує поняття про активний, селективний децидуальний фенотип, порушення якого може призвести до репродуктивних втрат.

Висновки

Узагальнюючи наведені дані, можна сказати, що основними патогенетичними ланками, що визначають успішність імплантації в програмі ДРТ, є гаметоембріональний і матковоендометріальний фактори, що перебувають у тісному взаємозв’язку. Характерними рисами діалогу «ембріон — ендометрій» є імунний, гормональний та цитокіновий взаємообмін і взаєморегуляція. Розуміння основних ланок патогенезу порушення імплантації дозволить розробити диференційовану схему лікувально­профілактичних заходів корекції дефектів селективності ендометрію, що покращить імплантацію ембріонів гарної якості, коли вони могли б бути відторгнуті, і запобігти неавторизованій імплантації ембріонів із низькою життєздатністю. Це повинно захистити жінок від тяжкого стресу, пов’язаного із звичними неефективними імплантаціями та звичним невиношуванням.