Международный неврологический журнал №5 (107), 2019

Введение

Повреждение нервных клеток головного мозга при демиелинизирующей патологии в значительной степени обусловлено развитием воспалительной реакции и оксидативного стресса. Важными составляющими таких процессов являются Т-лимфоциты и макрофаги/клетки микроглии, образующие реактивные радикалы и провоспалительные цитокины [1, 2]. Вместе с тем в головном мозге в динамике развития воспалительной реакции усиливается экспрессия противовоспалительных цитокинов, среди которых привлекает внимание интерлейкин-10 (IL-10). Существует мнение, что повышение экспрессии IL-10 при патологии центральной нервной системы (ЦНС) необходимо для защиты нервных клеток от повреждений [3]. Так, IL-10 снижает продукцию провоспалительных цитокинов и хемокинов, пролиферацию активированной микроглии/макрофагов, активность Т-хелперов 1-го типа при патологии ЦНС, в том числе у животных с моделью нейровоспаления [4, 5]. В свою очередь показано, что дифференцировка и активность Т-лимфоцитов, функционирование макрофагов находятся под контролем высокоактивного гормона тимуса тимулина [6, 7]. Есть данные о том, что IL-10 влияет на нейрогенез в головном мозге, выступая в качестве ростового фактора для нейрональных стволовых клеток (НСК) [8].

Представляется перспективным изучение возможных путей противовоспалительного влияния IL-10 на такой экспериментальной модели демиелинизации, как токсическая купризоновая модель. Это связано с тем, что в головном мозге молодых мышей, получавших нейротоксин купризон, наблюдается активация макрофагов с усилением синтеза провоспалительных цитокинов, накопление Т-лимфоцитов, оксидативный стресс и морфофункциональные нарушения ЦНС [9–12]. В результате исследований, проведенных ранее в лаборатории экспериментального моделирования института, показано, что под влиянием рекомбинантного IL-10 человека (rhIL-10) в головном мозге мышей с купризоновой диетой снижается число патологически измененных нейронов и, напротив, повышается число нейронов с неизмененной структурой [13].

Цель: исследовать изменения содержания макрофагов, Т-лимфоцитов, малонового диальдегида (МDА) и активности антиоксидантных ферментов в головном мозге, уровня в крови тимулина и поведенческие реакции у мышей, получавших нейротоксин купризон и рекомбинантный IL-10 человека.

Материалы и методы

Животные. В эксперименте использовали мышей-самцов линии 129/Sv в возрасте 4–7 месяцев стадной разводки вивария ГУ «Институт генетической и регенеративной медицины НАМН Украины». Мыши содержались в стандартных условиях вивария при фиксированном световом режиме 12 : 12.

Биологический материал для исследований получали от животных в утренние часы под эфирным наркозом. Все работы выполняли с соблюдением Закона Украины «О защите животных от жестокого обращения» от 21.02.2006 г., «Европейской Конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» (Страсбург, 1986).

Модели. В эксперименте использовали токсическую купризоновую модель демиелинизации, подробная характеристика которой была нами представлена ранее [9, 14]. Нейротоксин купризон (Sigma, США) давали мышам с пищей из расчета 0,2 % от суточного корма ежедневно в течение трех недель. Группа интактных мышей находилась на обычном рационе вивария.

RhIL-10 получали путем его синтеза в клетках выделенного ранее штамма-продуцента E. coli BL21(DE3)/pET24-hIL-10 [15]. Содержание целевого белка в лизате клеток E. coli и хроматографических фракциях оценивали методом денситометрии электрофореграмм с последующим анализом с помощью программы Total Lab (США). RhIL-10 вводили мышам с 7-го дня купризоновой диеты внутрибрюшинно, из расчета 5,0 мкг/кг массы, в 100 мкл фосфатного буфера, всего 3 инъекции с интервалом 3 дня.

Экспериментальные группы. 1-я — мыши, получавшие стандартную диету без купризона (интактные); 2-я — мыши, получавшие с едой купризон в течение 3 недель и инъекции фосфатного буфера (контрольная группа); 3-я — мыши, получавшие с едой купризон и инъекции rhIL-10. Каждая группа включала 12 мышей. Исследования проводили на следующий день после завершения приема купризона.

Методы. Факторы иммунной системы. При оценке функциональной активности макрофагов суспензию клеток головного мозга, адгезированных к пластику, культивировали с суспензией латекса (2,5 × 10⁸ мл) [9, 11]. Затем клетки фиксировали и окрашивали по Романовскому — Гимзе. В световом микроскопе подсчитывали не менее 200 макрофагов и определяли фагоцитарный индекс — процент фагоцитирующих клеток, фагоцитарное число — количество частиц латекса, поглощенное одним макрофагом.

При фенотипировании клеток головного мозга использовали моноклональные антитела (МАТ) к CD3, конъюгированные с флюорохромом (фикоэритрин) (Becton Dickinson, США). К гомогенату головного мозга (2 × 10⁵ клеток/50 мкл) добавляли соответствующие МАТ в разведении 1 : 50. Измерения проводили на лазерном проточном цитофлуориметре-сортере BD FACS Aria (Becton Dickinson, США) с помощью программы BD FACS Diva 6.1.

Эндокринную функцию тимуса исследовали по уровню тимулина (log₂) в сыворотке крови [6, 9].

Лейкоцитарную формулу периферической крови оценивали общепринятым методом.

Факторы оксидативного стресса и антиоксидантной защиты. Содержание малонового диальдегида (МDА) в головном (переднем) мозге определяли по интенсивности окраски триметинового комплекса, образующегося между МDА и тиобарбитуровой кислотой [16]. Активность антиоксидантных ферментов оценивали в супернатантах гомогенатов головного (переднего) мозга экспериментальных мышей спектрофотометрическим методом (спектрофотометр µQuant, Bio-Tek, США) [17]. Активность супероксиддисмутазы выражали в условных единицах на 1 мг белка за 1 мин, каталазы — в микромолях на 1 мг белка за 1 мин, глутатионпероксидазы — в наномолях на 1 мг белка за 1 мин. Содержание белка в ткани измеряли методом Лоури.

Поведенческие реакции у мышей изучали в тесте «открытого поля», который является одним из адекватных критериев оценки показателей их поведения [18]. Горизонтальную двигательную активность оценивали по количеству пересеченных квадратов, исследовательскую активность — по числу вертикальных стоек (вертикальная двигательная активность) и заглядываний в норки (норковый рефлекс), эмоциональную активность — по количеству фекальных болюсов. Тестирование экспериментальных мышей проводили в течение 3 минут.

Статистический анализ результатов проводили с помощью t-критерия Стьюдента. Различие между исследованными показателями считали статистически достоверным при значении p < 0,05.

Результаты

Влияние введения rhIL-10 на иммунные факторы у мышей с купризоновой диетой. Установлено, что повышенное количество СD3⁺-клеток в головном мозге мышей с купризоновой диетой снижается после инъекций rhIL-10, но не достигает значений интактных животных (табл. 1). Число макрофагов в головном мозге опытных мышей остается повышенным и после введения rhIL-10, однако фагоцитарная активность макрофагов значительно снижается (табл. 1). Уровень тимулина в крови мышей, получавших цитокин, существенно превышает таковой у мышей интактной и контрольной групп  (табл. 1).

Через 3 недели приема купризона количество моноцитов в периферической крови мышей меньше, чем в интактной группе, и составляет соответственно 2,5 ± 0,8 и 7,0 ± 1,3 %; p < 0,05). Известно [19], что при повреждениях головного мозга одним из источников макрофагов могут быть моноциты периферической крови. Об этом может свидетельствовать снижение количества моноцитов в периферической крови после приема купризона. После инъекций rhIL-10 значения показателя повышаются до уровня интактной группы (6,5 ± 1,2 %).

Влияние введения rhIL-10 на показатели оксидативного стресса и антиоксидантной защиты головного мозга мышей с купризоновой диетой. В головном мозге мышей, получавших купризон, наблюдается существенное повышение содержания MDA, которое не изменилось после инъекций rhIL-10 (табл. 2). Под влиянием rhIL-10 активность всех исследованных ферментов увеличивалась, при этом превышая значения показателей в интактной группе и группе контроля (табл. 2).

Влияние введения rhIL-10 на показатели поведения у мышей с купризоновой диетой. У мышей прием купризона приводит к существенному уменьшению показателей двигательной, эмоциональной и исследовательской активности (табл. 3). После инъекций rhIL-10 значения всех показателей существенно повышаются, причем число болюсов и вертикальных стоек — до уровня интактных животных.

Таким образом, в результате экспериментальных исследований установлены положительные изменения в головном мозге числа Т-лимфоцитов, активности макрофагов и антиоксидантных ферментов, а также уровня тимулина в крови мышей с купризоновой диетой, получавших инъекции rhIL-10. У таких мышей выявленные изменения иммунных факторов и антиоксидантной защиты сочетаются с улучшением функционального состояния ЦНС, оцениваемого по показателям поведенческих реакций.

Обсуждение

Из данных литературы известна важная роль IL-10 в патогенезе демиелинизирующей патологии, в частности рассеянного склероза [20, 21]. На модели экспериментального аллергического энцефаломиелита (ЭАЭ) показаны выраженные противовоспалительные свойства IL-10 в ЦНС, проявляющиеся в снижении синтеза провоспалительных цитокинов (тумор-некротический фактор (TNF-α), интерферон (IFN-γ), IL-1β), уменьшении экспрессии рецепторов к цитокинам и ингибировании их активации, угнетении активности Т-хелперов 1-го типа, клеток микроглии и т.д. [3, 4]. Такие эффекты цитокина коррелируют с течением ЭАЭ [21]. Более того, при развитии демиелинизирующей патологии концентрация в крови IL-10 снижается и, наоборот, повышается при ремиссии этого заболева-ния [20].

В связи с указанными выше данными заслуживает внимания установленный нами эффект rhIL-10 на макрофаги и Т-лимфоциты головного мозга мышей с купризоновой диетой. Как известно, макрофаги и Т-лимфоциты являются источником провоспалительных цитокинов и активных форм кислорода, повреждающих нервные клетки [1, 10, 22]. В условиях приема купризона содержание Т-лимфоцитов и макрофагов в головном мозге мышей существенно повышается.

В то же время уменьшение числа Т-лимфоцитов в головном мозге мышей, получавших купризон совместно с rhIL-10, может быть связано со снижением усиленной действием нейротоксина миграции этих клеток через гематоэнцефалический барьер [12]. Возможен апоптоз Т-лимфоцитов у таких мышей, так как в патологических условиях клетки активированной микроглии могут экспрессировать Fas ligand, который во-влекается в этот процесс [1]. Не исключается также развитие под влиянием цитокина анергии в Т-лимфоцитах головного мозга в результате ингибирования в этих клетках костимуляторных клеточных сигналов СD28, СD80 и СD86 [3].

Хотя после инъекций rhIL-10 число макрофагов в головном мозге опытных мышей остается все-таки выше, чем в интактной группе, их функциональная активность значительно снижается. Поскольку у таких мышей одновременно повышается количество структурно не измененных нейронов в ЦНС [13], можно предположить наличие у макрофагов противовоспалительного/регенераторного фенотипа. Возможность переключения фенотипа макрофагов с провоспалительного М1 на противовоспалительный М2 у мышей с купризоновой моделью демиелинизации показана исследованиями Gudi и соавт. [22].

Мы полагаем, что для изменений Т-лимфоцитов и макрофагов под влиянием rhIL-10 имеет значение усиление у животных эндокринной функции ти–муса. Известно влияние тимулина на активность макрофагов, дифференцировку Т-лимфоцитов и миграцию последних в организме [6, 7]. У животных с моделью нейровоспаления тимулин проявляет противовоспалительные свойства, снижая в головном мозге синтез провоспалительных цитокинов (TNF-α и IL-1β) и повышая синтез противовоспалительных цитокинов (IL-10) [23].

Не исключено, что повышение уровня тимулина в крови мышей после инъекций rhIL-10 может быть связано с изменением у таких животных функции коры надпочечников. Так, установлено, что уровень кортикостерона в крови мышей, получавших купризон, существенно повышается, а IL-10 снижает синтез глюкокортикоидов в коре надпочечников, действуя через рецепторы (IL-10R1) [24, 25]. В свою очередь, показано, что у мышей глюкокортикоиды угнетают образование гормонов в тимусе, а также изменяют в головном мозге фенотип микроглии на провоспалительный в условиях приема купризона [26, 27].

Нами установлен эффект rhIL-10 на факторы антиоксидантной защиты в головном мозге мышей с купризоновой диетой. Другими авторами также показано, что IL-10 путем частичного восстановления активности антиоксидантных ферментов уменьшает прооксидантный повреждающий эффект провоспалительных цитокинов (TNF-α) на клетки организма [28]. В нашей работе мы не обнаружили снижения содержания МDА в головном мозге мышей с купризоновой диетой, получавших rhIL-10. Однако возможно снижение под влиянием IL-10 продукции Н₂О₂ и NO макрофагами, которые были предварительно активированы провоспалительными цитокинами (IF-γ и TNF-α) [29].

Наряду с изменением иммунных факторов и антиоксидантной защиты эффекты rhIL-10 у мышей с купризоновой моделью демиелинизации можно объяснить его влиянием на нейрогенез в ЦНС. Так, показано, что IL-10 через свои рецепторы в НСК субвентрикулярной зоны головного мозга изменяет пролиферацию этих клеток [8]. При этом после инъекции rhIL-10 (50 мкг/кг) у животных как с купризоновой моделью демиелинизации, так и с ее другими экспериментальными моделями увеличение доли структурно не измененных нейронов (кора, гиппокамп, мозжечок головного мозга, поясничный отдел спинного мозга) сочетается со значительным повышением двигательной, эмоциональной и исследовательской активности [13, 30].

Вместе с тем в настоящем исследовании мы получили выраженный положительный эффект rhIL-10 на поведенческие реакции у мышей с купризоновой диетой уже в дозе цитокина 0,1 мкг/живот-ное, хотя структурные изменения нейронов ЦНС при такой дозе были незначительными [13]. Наши результаты подтверждают мнение Serra [25] о том, что нарушение поведенческих реакций при демиелинизирующей патологии может быть связано с развитием воспаления и повышенной экспрессией провоспалительных цитокинов в ЦНС, тогда как усиление таких реакций — со снижением проявлений воспаления. В последнем случае имеет также значение улучшение взаимодействий между функционированием отдельных структур ЦНС, которые были нарушены под влиянием купризона [25]. При этом мы не исключаем возможности получения отдаленного нейропротекторного эффекта rhIL-10 в дозе 5 мкг/кг у мышей с купризоновой моделью демиелинизации. Подобный эффект у мышей с этой моделью мы уже наблюдали у цитокина с нейротропными свойствами — лейкемия ингибиторного фактора [31].

Полученные нами результаты на купризоновой модели демиелинизации могут быть полезными при изучении эффектов rhIL-10 в комбинации с клеточной терапией этой патологии, в частности мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками (ММСК). В литературе уже представлены данные о повышении эффективности использования ММСК пуповины в сочетании с инъекциями rhIL-10 у животных с моделью ЭАЭ [30]. Предметом наших дальнейших исследований будет оценка эффективности влияния rhIL-10 на нейропротекторное действие ММСК костного мозга у мышей с купризоновой моделью демиелинизации.

Выводы

1. Инъекции rhIL-10 мышам с купризоновой моделью демиелинизации улучшают функциональное состояние ЦНС, оцениваемое по показателям двигательной, эмоциональной и исследовательской активности.

2. Эффект rhIL-10 у мышей с купризоновой диетой в значительной степени реализуется через изменение в головном мозге числа Т-лимфоцитов, активности макрофагов и антиоксидантных ферментов, а также эндокринной функции тимуса.

3. IL-10 или средства/подходы, повышающие его синтез в ЦНС, могут быть перспективными в схемах терапии демиелинизирующей патологии.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии какого-либо конфликта интересов при подготовке данной статьи.

Информация о финансировании: исследования выполнены по бюджетной теме № 0116U000139 при финансовой поддержке НАМНУ.