Международный эндокринологический журнал Том 19, №6, 2023

Актуальність. Червоний кістковий мозок (ЧКМ) є основним органом кровотворення людини. Моноцитопоез відіграє важливу роль у формуванні перехідних станів від норми до патології і в трансформації патологічних процесів з однієї стадії в іншу. У сучасній урологічній практиці трипторелін широко використовується для андрогендеприваційної терапії згідно з рекомендаціями Європейської асоціації урологів. Ki67, комерційно доступне моноклональне антитіло, що реагує з ядерним антигеном, виявленим лише в проліферуючих клітинах, використовується для оцінки імуногістохімічних змін. CD68 є цитохімічним маркером імунного забарвлення моноцитів/макрофагів у гістохімічному аналізі тканин при запаленні, раку та інших імуногістопатологічних процесах. Мета дослідження: oцінити проліферативну активність і диференціювання клітин-попередників через експресію Ki67 і CD68+ моноцитарного проростання ЧКМ за хімічної кастрації центрального походження у самців щурів, спричиненої введенням розчину триптореліну з додаванням кверцетину до раціону протягом одного року. Матеріали та методи. Дослідження проводилося на 60 дорослих самцях білих щурів. Тварин було поділено на 3 групи: І — контрольна (n = 10), ІІ (n = 25) — підшкірне введення триптореліну, ІІІ (n = 25) — підшкірне введення триптореліну ацетату і кверцетину. Імуногістохімічний аналіз біоптатів проводили за стандартним протоколом на кафедрі патологічної анатомії Сумського державного університету під керівництвом завідувача кафедри професора А.М. Романюка. Результати. Експресію Ki67 на мікрозрізах ЧКМ щурів оцінювали за допомогою імуногістохімічного аналізу, при якому відмічено реакцію виключно з ядерним антигеном у проліферуючих клітинах паростка моноцитів. Виявлено нерівномірні зміни залежно від експериментальних груп та періодів часу. Імуногістохімічний аналіз тканини ЧКМ з використанням антитіл проти CD68 в експериментальних групах показав сильну позитивну цитоплазматичну відповідь у моноцитах і резидентних макрофагах, розташованих у паростку моноцитів. Дані двох дослідних груп ЧКМ мали помітний проліферуючий компартмент, про що свідчить високий вміст у них мітотично-активної ДНК. Ці дані відповідають результатам, отриманим в експерименті з триптореліном, у якому виявлено помітну позитивність Ki67 залежно від часу експерименту та додавання флавоноїду кверцетину. Ця розбіжність свідчить про те, що клітини кісткового мозку, які ростуть і проліферують у нормальних умовах, керуються природними механізмами контролю і можуть втратити свою експресію Ki67 після того, як покинуть компартмент попередників і увійдуть у компартмент диференціювання. Висновки. Введення триптореліну викликає гормональний дисбаланс у системі «гіпоталамус — гіпофіз — яєчко — ЧКМ», що призводить до кількісних і якісних змін у клітинах моноцитарної лінії ЧКМ. Рівень клітинної проліферації за вимірюванням Ki67 був найвищим протягом третього місяця спостереження. Цитоплазматична експресія CD68 очевидна у двох експериментальних групах з третього по шостий місяць, що свідчить про активацію імунореактивних клітин, коли вони мігрують із компартменту попередника до компартменту диференціювання.

Background. Red bone marrow (RBM) is the main organ of human haemopoiesis. Monocytopoiesis plays an important role in the formation of transitional states: from normal to pathology and in the transformation of pathological processes from one stage to another. In modern urological practice, the substance triptorelin is widely used for androgen deprivation therapy, according to the recommendations of the European Association of Urology. Ki67, a commercially available monoclonal antibody that reacts with a nuclear antigen detected only in proliferating cells, is used to assess immunohistochemical changes. CD68 is a valuable cytochemical marker for immunostaining of monocytes/macrophages during histochemical analysis of tissues in inflammation, cancer and other immunohistopathological purposes. The purpose of the study is to evaluate the proliferative activity and differentiation of progenitor cells through the expression of Ki67 and CD68+ monocyte sprouting of RBM under chemical castration of central origin in male rats caused by the administration of triptorelin solution with quercetin addition to the diet for one year. Materials and methods. The study was conducted on 60 adult male white rats. They were divided into 3 groups: group I — control (n = 10), group II (n = 25) — subcutaneous injection of triptorelin, group III (n = 25) — subcutaneous injection of triptorelin acetate and quercetin. Immunohistochemical analysis of biopsy specimens was conducted following a standard protocol at the Department of Pathological Anatomy in Sumy State University, under the supervision of the Head of the Department, Prof. Romaniuk A.M. Results. The study evaluated Ki67 expression on microsections of rat red bone marrow through immunohistochemistry, which exclusively reacted with nuclear antigen in the monocyte sprout’s proliferating cells. Irregular changes were revealed depending on the experimental groups and time periods. Immunohistochemical analysis of RBM tissue using anti-CD68 antibodies in the experimental groups revealed a strong positive cytoplasmic response in monocytes and resident macrophages located in the monocyte sprout and surrounding environment. The data of the two experimental groups of RBM had a noticeable proliferating compartment, as evidenced by the high content of mitotically active DNA in them. These data correspond to the results obtained in the experiment with triptorelin, where we found a marked positivity of Ki67, depending on the timing of the experiment and the addition of the flavonoid quercetin. This discrepancy suggests that bone marrow cells that grow and proliferate under normal conditions are guided by natural control mechanisms and may lose their Ki67 expression after leaving the progenitor compartment and entering the differentiation compartment. Conclusions. Triptorelin administration induces hormonal imbalance in the hypothalamus-pituitary-testis-RBM system, resulting in quantitative and qualitative alterations in the cells of the RBM monocytic lineage. The level of cell proliferation, as measured by Ki67, is highest during the third month of observation. Cytoplasmic expression of CD68 is evident in two experimental groups from the third to the sixth month, suggesting activation of immunoreactive cells as they migrate from the progenitor compartment to the differentiation compartment.

система «гіпоталамус — гіпофіз — яєчко»; червоний кістковий мозок; моноцитопоез; Ki67; CD68; трипторелін

hypothalamus-pituitary-testis system; red bone marrow; monocytopoiesis; Ki67; CD68; triptorelin

1. Hays K. Physiology of normal bone marrow. Semin. Oncol. Nurs. 1990 Feb. 6(1). 3-8. doi: 10.1016/s0749-2081(05)80127-5.
2. Kumar M., Bhoi S. Cytokines, granulocyte-monocyte colony stimulating factor, interleukin-3 and erythropoietin: can be a thera–peutic option for the stimulation of hematopoietic progenitor cells in trauma-hemorrhagic shock? Indian J. Crit. Care Med. 2016 Apr. 20(4). 207-9. doi: 10.4103/0972-5229.180040.
3. Cuylen S., Blaukopf C., Politi A.Z., Müller-Reichert T., Neumann B. et al. Ki-67 acts as a biological surfactant to disperse mitotic chromosomes. Nature. 2016 Jul 14. 535(7611). 308-12. doi: 10.1038/nature18610.
4. Iqbal A.J., McNeill E., Kapellos T.S., Regan-Komito D., Norman S. et al. Human CD68 promoter GFP transgenic mice allow ana–lysis of monocyte to macrophage differentiation in vivo. Blood. 2014 Oct 9. 124(15). e33-44. doi: 10.1182/blood-2014-04-568691.
5. Kapellos T.S., Bonaguro L., Gemünd I., Reusch N., Saglam A. et al. Human Monocyte Subsets and Phenotypes in Major Chronic Inflammatory Diseases. Front. Immunol. 2019. 10. 2035. doi: 10.3389/fimmu.2019.02035.
6. Mottet N., Bellmunt J., Briers E. et al. Guidelines on prostate cancer. 2016. Available from: https://uroweb. org/guideline/prostate-cancer/.
7. Rud M.V., Shepitko V.I., Stetsuk Ye.V., Akimov O.Ye., Vilkhova O.V., Skotarenko T.A. The reaction of immunocompetent liver cells during chemical castration of male rats caused by the introduction of triptorelin acetate. World of Medicine and Biology. 2021. 2(76). 238-242. doi: 10.26724/2079-8334-2021-2-76-238-242.
8. Davis J.M., Murphy E.A., Carmichael M.D. Effects of the die–tary flavonoid quercetin upon performance and health. Curr. Sports Med. Rep. 2009 Jul-Aug. 8(4). 206-13. doi: 10.1249/JSR.0b013e3181ae8959.
9. Aguirre L., Arias N., Macarulla M.T., Gracia A., Portillo M.P. Beneficial effects of quercetin on obesity and diabetes. Open Nutraceuticals Journal. 2011. 4. 189-198.
10. Li Y., Yao J., Han C., Yang J., Chaudhry M.T., Wang S. et al. Inflammation and Immunity. Nutrients. 2016 Mar 15. 8(3). 167. doi: 10.3390/nu8030167.
11. Van Bockstaele D.R., Lan J., Snoeck H.W., Korthout M.L., De Bock R.F., Peetermans M.E. Aberrant Ki-67 expression in normal bone marrow revealed by multiparameter flow cytometric analysis. Cytometry. 1991. 12(1). 50-63. doi: 10.1002/cyto.990120108.
12. Chistiakov D., Killingsworth M., Myasoedova V. et al. CD68/macrosialin: not just a histochemical marker. Lab. Invest. 2017. 97. 4-13.
13. Lavin Y., Mortha A., Rahman A., Merad M. Regulation of macrophage development and function in peripheral tissues. Nat. Rev. Immunol. 2015. 15(12). 731-44.
14. Barros M.H., Hauck F., Dreyer J.H., Kempkes B., Niedobitek G. Macrophage polarisation: an immunohistochemical approach for identifying M1 and M2 macrophages. PLoS One. 2013 Nov 15. 8(11). e80908. doi: 10.1371/journal.pone.0080908.
15. Albadrani G.M., Binmowyna M.N., Bin-Jumah M.N., El-Aka–bawy G., Aldera H., Al-Farga A.M. Quercetin protects against experimentally-induced myocardial infarction in rats by an antioxidant potential and concomitant activation of signal transducer and activator of transcription. J. Physiol. Pharmacol. 2020 Dec. 71(6). 125-7. doi: 10.26402/jpp.2020.
16. Botté M.C., Lerrant Y., Lozach A., Bérault A., Counis R., Kottler M.L. LH down-regulates gonadotropin-releasing hormone (GnRH) receptor, but not GnRH, mRNA levels in the rat testis. J. Endocrinol. 1999. 162(3). 40915. doi: 10.1677/joe.0.1620409.
17. Bahriy M.M., Dibrova V.A., eds. Metodyky morfolohichnykh doslidzhen. Vinnytsya: Nova knyha; 2016. 328 p. (in Ukrainian).
18. Falini B., Canino S., Sacchi S., Ciani C., Martelli M.F. et al. Immunocytochemical evaluation of the percentage of proliferating cells in pathological bone marrow and peripheral blood samples with the Ki-67 and anti-bromo-deoxyuridine monoclonal antibodies. Br. J. Haematol. 1988 Jul. 69(3). 311-20. doi: 10.1111/j.1365-2141.1988.tb02368.x.
19. Gaglia P., Bernardi A., Venesio T., Caldarola B., Lauro D. et al. Cell proliferation of breast cancer evaluated by anti-BrdU and anti-Ki-67 antibodies: its prognostic value on short-term recurren–ces. Eur. J. Cancer. 1993. 29A(11). 1509-13. doi: 10.1016/0959-8049(93)90284-m.
20. Zhang J., Li S., Liu F., Yang K. Role of CD68 in tumor immunity and prognosis prediction in pan-cancer. Sci. Rep. 2022 May 12. 12(1). 7844. doi: 10.1038/s41598-022-11503-2.
21. Kolomiiets O., Moskalenko R. Immunohistochemical study of M1 and M2 macrophages in breast cancer with microcalcifications. East Ukr. Med. J. 2023. 11(2). 155-163. doi: 10.21272/eumj.2023.
22. Yemchenko Ya.O., Shynkevych V.I., Ishcheikin K.E., Kaidashev I.P. PPAR-Gamma Agonist Pioglitazone Reduced CD68+ but Not CD163+ Macrophage Dermal Infiltration in Obese Psoriatic Patients. PPAR Res. 2020. 2020. 4548012.
23. Berezhna V.A., Mamontova T.V., Gromova A.M. CD68+ M1 macrophages is associated with placental insufficiency under fetal growth restriction. Wiad. Lek. 2021. 74(2). 213-219.
24. Zelinka-Khobzey M.M., Tarasenko K.V., Mamontova T.V., Shlykova O.A. Characteristics of CD68+ and CD163+ expression in placenta of women with preeclampsia and obesity. Wiad. Lek. 2021. 74(9, cz. 1). 2152-2158.
25. Likhachov V.K., Vashchenko V.L., Taranovska O.O. Impact of preventive therapy on regulating mechanisms of decidual macrophage polarization in pregnant women with high risk of preeclamplsia. Wiad. Lek. 2021. 74(9, cz. 1). 2123-2127.
26. Meuret G., Detel U., Kilz H.P., Senn H.J., van Lessen H. Human monocytopoiesis in acute and chronic inflammation. Acta Haematol. 1975. 54(6). 328-35. doi: 10.1159/000208094.
27. Stetsuk Ye.V., Shepytko V.I., Akimov O.Ye., Boruta N.V., Rud M.V. et al. Dynamics of CD68 receptor expression in macrophages of the interstitial space of the rat testis under triptorelin prolonged administration. The Ukrainian Biochemical Journal. 2023. 2. 75-82. doi: 10.15407/ubj95.02.075.
28. Neoptolemos J.P., Wood P., Everson N.W., Bell P.R. Monocyte function following surgery in man. Increased numbers and stimu–lation of migration, phagocytosis and chemiluminescence following abdominal surgery. Eur. Surg. Res. 1985. 17(4). 215-20. doi: 10.1159/000128469.