Інформація призначена тільки для фахівців сфери охорони здоров'я, осіб,
які мають вищу або середню спеціальну медичну освіту.

Підтвердіть, що Ви є фахівцем у сфері охорони здоров'я.

Мобильная версия

Регистрация Забыли пароль?

Международный неврологический журнал Том 16, №1, 2020

Вернуться к номеру

Зміна глікозильних детермінант імуноглобулінів у хворих на розсіяний склероз як діагностичний маркер захворювання

Зміна глікозильних детермінант імуноглобулінів у хворих на розсіяний склероз як діагностичний маркер захворювання

Авторы: Гичка К.М.
Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького, м. Львів, Україна

Рубрики: Неврология

Разделы: Клинические исследования

Версия для печати


Резюме

Метою роботи було дослідження аспектів змін глікозильних детермінант людини при розсіяному склерозі (РС), які раніше не досліджували. Було проведено дослідження глікозилювання антитіл у цереброспінальній рідині (ЦСР), порівняння з антитілами сироватки крові та визначення їх природи. А також виявлення специфічного для розсіяного склерозу класу автоантитіл, що може слугувати надійним біомаркером цього захворювання. Матеріали та методи. Проаналізовано 18 зразків сироватки крові здорових донорів (ЗД) та 20 зразків сироватки крові хворих на РС, із них 12 зразків ЦСР хворих на РС. Результати. Аналіз імунних комплексів молекул IgM, зв’язаних із молекулами IgG, показав значну різницю у їх вмісті між сироваткою ЗД та сироваткою пацієнтів із РС, у яких спостерігався вірогідно вищий вміст імунних комплексів IgG–IgM. Лектин-імуноферментний аналіз досліджуваних сироваток показав, що рівень експонування сіалових залишків, виявлений з лектином SNA, є вірогідно вищим у сироватках хворих на РС порівняно зі здоровими донорами. Також було відзначено зростання рівня експонування залишків фукози на імуноглобулінах як сироватки, так і ЦСР у хворих на РС порівняно зі здоровими донорами. При цьому рівень їх експонування на імуноглобулінах ЦСР був вірогідно вищим за такий в імуноглобулінах сироватки. Висновки. Рівень експонування фукозильних і сіалових залишків у сироватці та ЦСР у хворих на РС вірогідно різниться. Кількість детектованих молекул імуноглобулінів у всіх випадках була однаковою. У такий спосіб було показано, що в досліджуваних зразках сироваток та ЦСР хворих на РС відбуваються значні зміни експонування термінальних сіалових кислот і корових фукозильних залишків, які не пов’язані із зміною кількості самих N-гліканів чи появою додаткових сайтів глікозилювання на молекулах імуноглобулінів.

Целью работы было исследование аспектов изменений гликозильных детерминант человека при рассеянном склерозе (РС), которые ранее не исследовались. Было проведено исследование гликозилирования антител в цереброспинальной жидкости (ЦСЖ), сравнение с антителами сыворотки крови и определение их природы. А также выявление специфического для рассеянного склероза класса аутоантител, что может служить надежным биомаркером этого заболевания. Материалы и методы. Проанализированы 18 образцов сыворотки крови здоровых доноров (ЗД) и 20 образцов сыворотки крови больных РС, из них 12 образцов ЦСЖ больных РС. Результаты. Анализ иммунных комплексов молекул IgM, связанных с молекулами IgG, показал значительную разницу в их содержании между сывороткой ЗД и сывороткой пациентов с РС, у которых наблюдалось достоверно более высокое содержание иммунных комплексов IgG–IgM. Лектин-иммуноферментный анализ исследуемых сывороток показал, что уровень экспонирования сиаловых остатков, обнаруженных с лектином SNA, является достоверно более высоким в сыворотках больных РС по сравнению со здоровыми донорами. Также был отмечен рост уровня экспонирования остатков фукозы на иммуноглобулинах как сыворотки, так и ЦСЖ у больных РС по сравнению со здоровыми донорами. При этом уровень их экспонирования на иммуноглобулинах ЦСЖ был достоверно выше такового в иммуноглобулинах сыворотки. Выводы. Уровень экспонирования фукозильных и сиаловых остатков в сыворотке и ЦСЖ у больных РС достоверно различается. Количество детектированных молекул иммуноглобулинов во всех случаях было одинаковым. Таким образом было показано, что в исследуемых образцах сывороток и ЦСЖ больных РС происходят значительные изменения экспонирования терминальных сиаловых кислот и коревых фукозильных остатков, которые не связаны с изменением количества самих N-гликанов или появлением дополнительных сайтов гликозилирования на молекулах иммуноглобулинов.

Background. The study aimed to investigate the aspects of glycosyl determinants alteration in human with multiple sclerosis that have not been studied before. Materials and ­methods. Glycosylation of antibodies in cerebrospinal fluid (CSF) have been studied and compared with serum antibodies with the determination of their nature. The detection of multiple sclerosis (MS) specific autoantibodies can serve as a reliable biomarker for this disease. Eighteen samples of serum of healthy donors (HD) and 20 samples of serum of patients with MS were analysed, 12 of which were samples of CSF of patients with MS. Results. An analysis of the immune complexes of IgM molecules bound to IgG molecules revealed a significant difference in their content between the serum of HD and the serum of patients with MS who had slightly higher levels of IgG-IgM immune complexes. Lectin enzyme-linked immunosorbent analysis has shown that the level of exposure of sialic residues detected with SNA lectin was significantly higher in patients with MS compared to healthy donors. There was also an increase in the level of exposure of fucose residues to both serum and CSF immunoglobulins in MS patients compared to healthy donors. The level of their exposure to CSF immunoglobulins was significantly higher than a level in serum immunoglobulins. Conclusions. The level of exposure of fucosyl and sialyl residues to the serum and CSF in MS patients significantly differs. In all cases, the number of immunoglobulin molecules detected was the same. Thus, it was shown that in the tested samples of sera and CSF of the patients with MS, the exposure of terminal sialic acids and bark fucosyl residues significantly altered, which was not associated with changes in the number of N-glycans themselves or the appearance of additional glycosylation sites on immunoglobulins molecules.


Ключевые слова

глікозилювання; ліквор; розсіяний склероз; імуноглобуліни; біомаркер

гликозилирование; ликвор; рассеянный склероз; иммуноглобулины; биомаркер

glycosylation; cerebrospinal fluid; multiple sclerosis; immunoglobulins; biomarker

doi: http://dx.doi.org/10.22141/2224-0713.16.1.2020.197327

Вступ

Розсіяний склероз (РС) — автоімунне захворювання центральної нервової системи, що характеризується пошкодженням мієлінової оболонки та дегенерацією аксонів [1], є найбільш поширеною нетравматичною причиною інвалідності у молодих людей [2–4].
Зважаючи на мультифакторність захворювання та велику кількість мішеней, що зазнають атаки, діагностика захворювання залишається ускладненою. Станом на сьогодні немає єдиної клінічної ознаки або діагностичного тесту, достатніх для абсолютно точного виявлення РС. Одним з механізмів, що призводять до запальних автоімунних захворювань, є порушення усунення клітинних решток, що спричинять розпад останніх, утворення модифікованих клітинних компонентів, що провокують утворення антитіл до власних компонентів — автоантитіл, та ініціацію автоімунної реакції [5]. При розсіяному склерозі автоантитіла атакують компоненти нервової системи — нервові провідники, вкриті мієліновою оболонкою [6]. 
Глікозилювання автоантитіл суттєво впливає на їх патогенність [7–9]. Відомо, що при деяких автоімунних захворюваннях відбуваються зміни гліканового складу молекул імуноглобуліну G, які обумовлені тяжкістю захворювання або терапією [10–14]. Зважаючи на важливу роль, яку патогенні антитіла відіграють у розвитку РС, можливість потенційно змінювати глікозилювання мала б великий терапевтичний потенціал, а за наявності характерних змін, притаманних цьому захворюванню, — діагностичний.
Метою цієї роботи було дослідження аспектів змін глікозильних детермінант людини при розсіяному склерозі, які раніше не досліджували. Тому ми сконцентрувались на двох головних напрямках — дослідженнях глікозилювання антитіл у цереброспінальній рідині (ЦСР) та його порівнянні з антитілами сироватки крові хворих на розсіяний склероз.

Матеріали та методи

Наведена робота була виконана на кафедрі неврології Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького та у Львівському обласному науковому центрі з вивчення проблем розсіяного склерозу та інших демієлінізуючих захворювань, що знаходиться на базі Львівської обласної клінічної лікарні.
Дослідження ґрунтувалось на положеннях Гельсінської декларації. Комісією з питань біомедичної етики Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького (протокол № 5 від 23 лютого 2017 р.) встановлено, що ця наукова робота відповідає етичним та морально-правовим вимогам згідно з Наказом Міністерства охорони здоров’я України № 281 від 01.11.2000 р. Від усіх учасників дослідження було отримано письмову інформовану згоду на участь у дослідженні.
Було проаналізовано 18 зразків сироватки здорових донорів та 20 зразків сироватки хворих на РС, а також 12 зразків ЦСР хворих на РС, які проходили комплексне амбулаторне або стаціонарне лікування на клінічній базі кафедри неврології (неврологічне відділення КЗ ЛОР «Львівська обласна клінічна лікарня»). Усі пацієнти з РС відповідали критеріям Макдональда 2010 року, під час клінічного обстеження пацієнтам була проведена магнітно-резонансна томографія голови, 12 пацієнтам — люмбальна пункція для визначення олігоклональних антитіл. Обстежені пацієнти з досліджуваної групи були віком від 24 до 50 років, середній вік становив 35,05 ± 10,13 року. Середній вік жінок — 33,86 ± 10,39 року, середній вік чоловіків — 38,61 ± 9,39 року. Середня тривалість РС у хворих становила 3,45 ± 1,92 року. Середня тривалість захворювання у жінок — 3,61 ± 1,39 року, у чоловіків — 3,31 ± 1,75 року. З-поміж аналізованих пацієнтів більшість становили жінки — 75 % (n = 15), 25 % (n = 5) — чоловіки.
Для визначення змін глікозилювання імуноглобулінів IgG сироватки у 96-лунковий імунологічний планшет (Nunc, Maxisorp) вносили по 50 мкл AffiniPure F(ab’)2 Fragment Goat Anti-human IgG (H+L) із концентрацією 2 мкг/мл в 0,1 М карбонатному/бікарбонатному буфері, рН 9,6. Планшети інкубували 12 год при 4 °С. Відмивали три рази трис-сольовим буфером (ТСБ)-Tween (0,05%) (ТСБ-Т), який містив 0,1 M CaCl2, MgCl2. Вільні сайти зв’язування блокували 3% деглікозильованим желатином у ТСБ-Т/0,1 M CaCl2, MgCl2, по 100 мкл/лунку протягом 2 год при 37 °C. Відмивали три рази ТСБ-Т/0,1 M CaCl2, MgCl2 та вносили сироватку у розведенні 1 : 1000. Інкубували 1 год при кімнатній температурі. Відмивали три рази ТСБ-Т/0,1 M CaCl2, MgCl2 та додавали біотинільовані лектини (LCA, AAL, PSqL та SNA) у концентрації 5–10 нг/мл. Інкубували 1 год при кімнатній температурі. Відмивали три рази ТСБ-Т/0,1 M CaCl2, MgCl2, вносили мічений пероксидазою стрептавідин (1 : 10 000) та інкубували 1 год при кімнатній температурі. Відмивали три рази ТСБ-Т/0,1 M CaCl2, MgCl2 та вносили по 50 мкл субстрату ТМБ. Інкубували 10–15 хв у темноті. Реакцію зупиняли додаванням 50 мкл 10% сульфатної кислоти та вимірювали поглинання при 450 нм, використовуючи мікропланшетний аналізатор PerkinElmer HTS 7000.
Статистичний аналіз даних проводили з використанням програмного забезпечення OriginPro (OriginLab), Prism7 (GraphPad) та Excel (Microsoft). Для оцінки відмінності досліджуваних масивів даних використовували такі критерії: для параметричних даних — t-критерій Стьюдента (парний і непарний), дисперсійний аналіз (ANOVA) для визначення зв’язку між багатьма зразками; для непараметричних даних використовували U-критерій Манна — Уїтні. Для кожного з параметрів визначали рівень вірогідності, використовували 3 градації рівнів вірогідності: * — p < 0,05; ** — p < 0,01; *** — p < 0,001. Дані вважали вірогідними, якщо p < 0,05. Для отриманих даних визначали середні значення та стандартну похибку середнього (M ± m).

Результати та обговорення

Оскільки вміст імуноглобулінів у сироватці та ЦСР суттєво різниться, для порівняння оцінки експонування гліканів на молекулах імуноглобулінів було запропоновано модифікацію методу лектин-імуноферментного аналізу [15], де рівномірність аналізу імуноглобулінів забезпечувалась шляхом насичення антитіл-уловлювачів молекул імуноглобулінів IgG. Схема аналізу подана на рис. 1. Для забезпечення насичення використовували розведення сироваток 1 : 1000 та ЦСР — 1 : 10. 
Для перевірки рівномірності зв’язування імуноглобулінів IgG у використаній системі було проведено визначення вмісту зв’язаних антитіл, використовуючи детектуючі антитіла, специфічні проти імуноглобуліну IgG людини, мічені пероксидазою. Як видно з рис. 2, вміст зв’язаних антитіл, що піддавався аналізу, був однаковим (статистично не відрізнявся) серед зразків сироватки здорових донорів та хворих на РС, а також зразків ЦСР хворих на РС.
Відомо, що вміст імунних комплексів, зокрема тих, які містять молекули IgG, може змінюватись при РС, і оскільки молекули імуноглобулінів у складі комплексів також експонують сайти глікозилювання, було проведено аналіз вмісту імунних комплексів IgG–IgM у досліджуваних зразках. Для цього вловлювали імуноглобуліни IgG на поверхні імуноферментних планшетів за допомогою сорбованих F(ab)2 фрагментів, специфічних до Fc-ділянки імуноглобулінів IgG людини, а детекцію комплексів проводили за допомогою антитіл, специфічних до імуноглобулінів IgM людини, мічених пероксидазою. Таким чином, позитивний сигнал реакції забезпечувався, лише коли в суміші були комплекси IgG–IgM.
Аналіз імунних комплексів молекул IgM, зв’язаних із молекулами IgG, показав значну різницю у їх вмісті між сироваткою ЗД, сироваткою пацієнтів із РС, у яких спостерігався вірогідно вищий вміст імунних комплексів IgG–IgM (p < 0,0001), та ЦСР хворих на РС, у якій виявлялась набагато менша кількість імунних комплексів (p < 0,0001), яка була близькою до нижньої межі інструментальних методів детекції (рис. 3). Це свідчить про цілісність гематоенцефалічного бар’єру та той факт, що імуноглобуліни сироватки та ЦСР є різними за генезом молекулами, які вільно не перемішуються через гематоенцефалічний бар’єр.
Термінальні залишки сіалових кислот визначають антизапальні властивості молекул імуноглобулінів G [16]. Для виявлення їх експонування використовували лектини SNA (специфічний до термінальних сіалових кислот, приєднаних α2,6-зв’язком до галактози) та PSqL (специфічний до термінальних сіалових кислот, приєднаних α2,6-зв’язком до галактози в складі біантенних N-гліканів) [15, 17]. Лектин-імуноферментний аналіз досліджуваних сироваток показав, що рівень експонування сіалових залишків, виявлений з лектином SNA, є вірогідно вищим у сироватках хворих на РС порівняно із здоровими донорами, що добре узгоджується із раніше виявленими особливостями імуноглобулінів при РС [18], та є вірогідно нижчим у зразках ЦСР, при цьому рівень зв’язування лектину SNA із лігандами на імуноглобулінах G у зразках ЦСР є вірогідно нижчим за такий у зразках сироваток здорових донорів (рис. 4).
Лектин SNA виявляє експонування α2,6-зв’язаних залишків сіалової кислоти, які здебільшого присутні на імуноглобулінах у формі біантенних розгалужених гліканів, проте, щоб виключити можливе інше джерело приєднання даних сіалових залишків (наприклад, у складі О-гліканів), додатково був використаний лектин Polyporus squamosus, люб’язно наданий професором Г.-Й. Габіусом, що виявляє специфічність до α2,6-сіалових залишків лише у складі N-гліканів [19]. Передбачувано, спостерігали подібну залежність (рис. 5) — рівень експонування сіалових залишків був вищим у сироватках хворих на РС та набагато нижчим у цереброспінальній рідині хворих на РС. З отриманих даних зробили висновок, що склад гліканів за рівнем сіалування суттєво різниться у сироватці та цереброспінальній рідині, а також що в досліджуваному випадку ми спостерігаємо зміну експонування залишків сіалових кислот на біантенному N-глікані молекул імуноглобулінів.
У попередніх дослідженнях було описане вірогідне зростання експонування рівня фукозовмісних залишків на молекулах імуноглобулінів при індукції запалення різними зовнішніми антигенами [20]. Воно спостерігалось при хронічних автоімунних захворюваннях на зразок системного червоного вовчака, а рівень експонування корелював із рівнем активності захворювання [11]. Як показано в роботі [10], експонування даних глікозильних залишків на імуноглобулінах при автоімунних формах ревматоїдного артриту дозволяло передбачити період загострення хвороби. Оскільки як РА, так і РС є антитілозалежними хронічними захворюваннями, що характеризуються періодами загострення та ремісії, ми звернули увагу на експонування лігандів лектину LCA у зразках сироватки і ЦСР при РС. Результати лектин-імуноферментного аналізу, наведеного на рис. 6, свідчать про підвищений рівень експонування кору N-гліканів при РС як в зразках сироватки, так і в зразках ЦСР. Зростання значень експонування гліканів у групах сироваток здорових донорів та хворих на РС було вірогідно значущим (рис. 6).
Отже, рівень експонування фукозильних і сіалових залишків у сироватці та ЦСР у хворих на РС вірогідно різниться. Кількість детектованих молекул імуноглобулінів у всіх випадках була однаковою (рис. 2). У такий спосіб нами було показано, що в досліджуваних зразках сироваток та ЦСР хворих на РС відбуваються значні зміни експонування термінальних сіалових кислот та корових фукозильних залишків, які не пов’язані із зміною кількості самих N-гліканів чи появою додаткових сайтів глікозилювання на молекулах імуноглобулінів.

Висновки

Виявлені зміни щодо експонування гліканів у сироватках здорових донорів, сироватках пацієнтів з РС та ЦСР пацієнтів з РС вказали на істотні зміни глікозилювання, що дозволяли відрізнити як сироватку ЗД від сироватки пацієнтів, так і ЦСР від сироватки пацієнтів з РС, що несе в собі важливий діагностично-прогностичний потенціал при цьому захворюванні. Показано, що зміни імуноглобулінів сироватки у пацієнтів із розсіяним склерозом носять прозапальний характер, подібний до такого при інших досліджених автоімунних захворюваннях. 
Глікозилювання імуноглобулінів цереброспінальної рідини вірогідно різниться від глікозилювання імуноглобулінів сироватки, що можна використовувати як важливий діагностичний маркер при РС, тому що визначення даних показників у крові є набагато простішим та доступнішим методом діагностики порівняно з ліквором. 
Конфлікт інтересів. Автор заявляє про відсутність конфлікту інтересів та власної фінансової зацікавленості при підготовці даної статті.

Список литературы

1. Lassmann H., Brück W., Lucchinetti C.F. The immunopathology of multiple sclerosis: anoverview. Brain Pathol. 2007. № 17. P. 210-8. doi: 10.1111/j.1750-3639.2007.00064.x.

2. Негрич Т.І., Євтушенко С.К., Сорокін Б.В., Москаленко М.А. Доказова база методів діагностики і лікування розсіяного склерозу. Міжнародний неврологічний журнал. 2012. № 5(51). С. 25-30.

3. Conway D., Cohen J.A. Emerging oral therapies in multiple sclerosis. Current neurology and neuroscience reports. 2010. Vol. 10. № 5. P. 381-388.

4. Compston A., Coles A. Multiple sclerosis. Lancet. 2002. Vol. 359. P. 1221-1231.

5. Baumann I., Kolowos W., Voll R.E. et al. Impaired uptake of apoptotic cells into tingible body macrophages in germinal centers of patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum. 2002. № 46. Р. 191-201. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=11817590.

6. Blauth K., Owens G.P., Bennett J.L. The Ins and Outs of B Cells in Multiple Sclerosis. Front. Immunol. 2015. № 6. Р. 1-7. Available from: http://journal.frontiersin.org/Article/10.3389/fimmu.2015.00565/abstract.

7. Fickentscher C., Magorivska I., Janko C. et al. The Pathogenicity of Anti-β 2GP1-IgG Autoantibodies Depends on Fc Glycosylation. J. Immunol. Res. 2015. № 2015. Р. 1-12. Available from: http://www.hindawi.com/journals/jir/2015/638129/.

8. Imafuku Y., Yoshida H., Yamada Y. Reactivity of agalactosyl IgG with rheumatoid factor. Clin. Chim. Acta. 2003. № 334. Р. 217-223.

9. Lin C.-W., Tsai M.-H., Li S.-T. et al. A common glycan structure on immunoglobulin G for enhancement of effector functions. Proc. Natl. Acad. Sci. 2015. № 112. Р. 10611-10616. Available from: http://www.pnas.org/lookup/doi/10.1073/pnas.1513456112.

10. Stümer J., Biermann M., Knopf J. et al. Altered glycan accessibility on native immunoglobulin G complexes in early rheumatoid arthritis and its changes during therapy. Clin. Exp. Immunol. 2017. № 189. Р. 372-382. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28509333.

11. Sjöwall C., Zapf J., von Löhneysen S. et al. Altered glycosylation of complexed native IgG molecules is associated with disease activity of systemic lupus erythematosus. Lupus. 2015. № 24. 569-581. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25389233.

12. Ercan A., Barnes M.G., Hazen M. et al. Multiple juvenile idiopathic arthritis subtypes demonstrate proinflammatory IgG glycosylation. Arthritis Rheum. 2012. № 64. Р. 3025-3033.

13. Fokkink W.J.R., Selman M.H.J., Dortland J.R. et al. IgG Fc N-glycosylation in Guillain-Barré syndrome treated with immunoglobulins. J. Proteome Res. 2014. № 13. Р. 1722-1730.

14. Selman M.H.J., Niks E.H., Titulaer M.J. et al. IgG fc N-glycosylation changes in Lambert-Eaton myasthenic syndrome and myasthenia gravis. J. Proteome Res. 2011. № 10. Р. 143-152. Avai-lable from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20672848.

15. Магорівська І.Б., Томін А.М., Думич Т.І. та ін. Спосіб оцінки параметрів молекул імуноглобуліну класу IgG у зразках сироватки крові. UA, UA: Патент України на корисну модель 95297. 2014. С. 1-6.

16. Kaneko Y., Nimmerjahn F., Ravetch J.V. Anti-inflammatory activity of immunoglobulin G resulting from Fc sialylation. Science. 2006. № 313. Р. 670-673. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=16888140.

17. Магорівська І.Б., Білий Р.О., Муноз Л. та ін. Рівень сіалування антигістонових антитіл сироватки крові хворих на системний червоний вовчак. Біологічні студії. 2012. № 6. С. 55-64.

18. Paryzhak S., Dumych T., Mahorivska I. et al. Neutrophil-released enzymes can influence composition of circulating immune complexes in multiple sclerosis. Autoimmunity. 2018. № 51. Р. 297-303. Available from: https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/08916934.2018.1514390.

19. Mo H., Winter H.C., Goldstein I.J. Purification and characterization of a Neu5Acalpha2-6Galbeta1-4Glc/GlcNAc-specific lectin from the fruiting body of the polypore mushroom Polyporus squamosus. J. Biol. Chem. 2000. № 275. Р. 10623-10629. Available from: http://www.jbc.org/content/275/14/10623.abstract.

20. Chen S., Lu C., Gu H. et al. Aleuria Aurantia Lectin (AAL)-Reactive Immunoglobulin G Rapidly Appears in Sera of Animals following Antigen Exposure. PLoS One. 2012. № 7.


Вернуться к номеру